張藝璇 呂 瑛

南京大學醫(yī)學院附屬鼓樓醫(yī)院消化內(nèi)科(210008)

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化系統(tǒng)腫瘤，預后通常不佳，位列世界癌癥相關死亡的第三位，5年生存率低于9%[1]。手術切除是患者獲得長期生存的最佳選擇，但由于特殊的解剖位置和疾病早期的非特異性癥狀以及缺乏有效的早期診斷方法，僅小部分患者(<15%)在診斷胰腺癌時還有手術切除的機會，但這部分患者的5年總體生存率低于30%[2]。因此，早期診斷是改善胰腺癌預后的關鍵。有研究指出，從胰腺發(fā)生突變發(fā)展到轉移性胰腺癌的時間需近21年[3]，這為早期診斷胰腺癌提供了廣闊的時間窗。因此，尋找高敏感性和特異性且可檢測無癥狀惡性或早期胰腺癌的生物學標志物對延長胰腺癌患者的生存期具有重要意義。

外泌體是由幾乎所有哺乳動物細胞類型包括肥大細胞、樹突細胞、B細胞、脂肪細胞、內(nèi)皮細胞、神經(jīng)元等分泌的內(nèi)吞起源的納米級(30～150 nm)細胞外囊泡，胞質內(nèi)含有脂質、蛋白質、DNA、微小RNA(microRNA, miRNA)、mRNA、長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA, LncRNA)等，廣泛存在于血液、尿液、唾液等多種體液中。癌癥患者的外泌體總量顯著高于健康人[4]。此外，腫瘤來源的外泌體攜帶大量親代細胞的信息，提供了獲取腫瘤分子信息的微創(chuàng)途徑，代表了腫瘤細胞的集合參數(shù)，且可重復采樣進行縱向監(jiān)測，可作為有效的替代生物學標志物來確定腫瘤的類型和分期[5]。

一、外泌體作為胰腺癌診斷標志物的概述

1.外泌體概述：Johnstone發(fā)現(xiàn)了一種由網(wǎng)織紅細胞釋放并分泌到細胞外基質中的囊泡，將其命名為外泌體[6]。外泌體是具有脂質雙層膜結構的納米級囊泡，通過攜帶非編碼RNA、蛋白質等介導局部與全身的細胞間相互作用[7]。

2.外泌體作為胰腺癌診斷標志物的優(yōu)勢：①外泌體脂質雙層膜對內(nèi)含的核酸和蛋白質具有保護作用，使其免受核酸酶和蛋白酶的降解，是可靠的循環(huán)生物學標志物[5]；②外泌體減低了流體的復雜性，提高了低豐度分子檢出的敏感性[8]；③非侵入性收集外泌體中包含的多種核酸和蛋白質進行多參數(shù)測量，從而對特定疾病狀態(tài)進行分類，可實時監(jiān)測病情進展和治療效果以及判斷預后[9]。

3.外泌體的分離和提取：外泌體診斷早期胰腺癌需要高回收率、高純度、省時、低成本、高敏感性、高特異性的外泌體分離檢測技術。

①傳統(tǒng)的高通量方法：超速離心和密度梯度離心是使用最廣泛的外泌體一級分離方法[10]。其中金標準超速離心法操作簡單，獲得的外泌體數(shù)量相對較多，但耗時長，物理剪切力會損傷外泌體，轉子類型不同可能會導致回收率不穩(wěn)定，且純度也受到質疑[11]。

②新方法：Gao等[12]將TiO2與外泌體脂質雙層上的磷酸基團具有高度親和性并發(fā)生特異性結合，可應用于外泌體的分離，下游表征和蛋白質組學分析表明，該法可在5 min內(nèi)將外泌體從人血清中可逆性分離，且回收率高達93.4%。Lewis等[13]利用交流電動力學微陣列芯片在15～20 min內(nèi)直接從未經(jīng)任何預處理或添加稀釋樣品的全血、血漿或血清中分離出外泌體，并在30 min內(nèi)對胰腺癌患者目標生物學標志物進行特異性鑒定和定量，將傳統(tǒng)的樣品制備、外泌體分離與鑒定等復雜過程集成到簡單有效的分析模型中。微流控技術是一種新興的外泌體分離技術，具有樣本需求量小、大規(guī)模集成、檢測速度快、可進行高通量分析等優(yōu)勢，非常適合作為床邊診斷的工具[14]。但由于低通量和納米流體易堵塞，限制了微流控技術的大規(guī)模應用。有研究[15]開發(fā)了一種多通道納米流體系統(tǒng)分析原始臨床樣品，可從健康和患病的臨床隊列中分離出外泌體，并分析外泌體內(nèi)的RNA成分，應用機器學習算法生成預測性面板，成功地在盲法研究中區(qū)分出胰腺癌患者與健康受試者。

③胰腺癌外泌體的分離：提高外泌體診斷胰腺癌效能的兩大主要挑戰(zhàn)分別是如何將外泌體從特定細胞中分離出來以及如何在單個囊泡水平上表征外泌體亞群[16]。Lennon等[17]通過納米粒子跟蹤分析、蛋白質組學、轉錄組學、透射電子顯微鏡以及定量單分子定位顯微鏡(qSMLM)，從培養(yǎng)的細胞株對不同來源的外泌體進行初步評估。使用基于敏感熒光成像的qSMLM可量化各外泌體的大小和生物學標志物含量。qSMLM檢測血漿樣本可成功鑒別出富含胰腺癌外泌體的人群，開發(fā)了一種用于單個囊泡的單分子表征策略。

二、外泌體在早期診斷胰腺癌中的應用

胰腺癌生物學標志物CA19-9診斷晚期和有癥狀胰腺癌的敏感性和特異性分別為80%和82%，但在未發(fā)生轉移的小病變中，診斷敏感性和特異性迅速下降[18]。此外，5%～10%的人群并不能產(chǎn)生CA19-9[19]。因此亟待探索一種有效、廉價、非侵入性的胰腺癌特異性生物學標志物。

腫瘤細胞釋放外泌體至外周血循環(huán)，為基因組、蛋白質組等組學技術獲取循環(huán)外泌體所攜帶的與親代細胞有關的核酸和蛋白質等特異性生物學信息提供了可能，可從分子水平實現(xiàn)胰腺癌的早期診斷。

1.外泌體蛋白質：外泌體蛋白質可分為兩大類：①外泌體中普遍存在的蛋白，如四次跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)、腫瘤易感基因101(TSG101)蛋白、熱休克蛋白(HSP)70、HSP90等，是目前公認的外泌體特異性標志物[20]。②因親代細胞來源而異的蛋白，可作為胰腺癌特異性外泌體生物學標志物[21]。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC1)由蛋白質連接三個硫酸乙酰肝素組成，在胰腺癌等癌癥細胞中異常表達，介導癌細胞的生長、轉移和血管生成[22]。Melo等[23]的研究行質譜分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的外泌體富含GPC1，以流式細胞儀分離GPC1陽性的外泌體后，可鑒別健康受試者與胰腺癌患者；進一步多元回歸分析證實GPC1陽性外泌體可單獨作為生物學標志物預測疾病特異性生存期。說明外泌體GPC1可作為胰腺癌的診斷標志物。Buscail等[24]的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，胰腺癌患者的外泌體GPC1顯著高于無癌癥史和胰腺癌前病變對照組，聯(lián)合門靜脈血和外周血結果的診斷準確性可達78%。但有研究指出，Melo等的研究納入的胰腺癌患者多處于晚期，僅包括少數(shù)癌前病變，故研究結論可能存在偏倚[25]。Lucien等[26]的研究結果顯示血漿GPC1外泌體水平并不能區(qū)分胰腺癌和胰腺良性疾病患者。Lai等[27]發(fā)現(xiàn)血漿外泌體GPC1水平無法區(qū)分胰腺癌與非腫瘤性對照組，且腫瘤切除后外泌體GPC1水平僅略降低，而胰腺癌患者外泌體miRNA水平明顯升高，并在胰腺切除后恢復正常。表明miRNA診斷胰腺癌的效能優(yōu)于GPC1。上述研究結果存在差異的原因可能是首先GPC1并不是一種組織特異性蛋白質，癌組織表達的GPC1可能與其他組織的正常分泌物混雜在一起。其次，許多實驗采用血清樣本檢測GPC1，血清中含有大量活性凝血因子，并不能確定其是否會裂解GPC1，導致錯誤的結果[22]。此外，不同的樣本量或應用不同的GPC1抗體亦可能會導致結果發(fā)生差異[28]。因此，GPC1是否可作為胰腺癌的診斷標志物仍需后續(xù)研究進一步證實。

2.外泌體核酸：與蛋白質生物學標志物相比，檢測RNA具有更高的敏感性和特異性，且分析成本更低。與DNA相比，RNA生物學標志物可更好地動態(tài)觀察細胞的調(diào)控和狀態(tài)，且circRNA和miRNA的穩(wěn)定性較高。Srinivasan等[29]采用Illumina TruSeq法對外泌體小RNA進行多次重復性測序，證實了高通量測序分析外泌體中小RNA作為生物學標志物來區(qū)分正常和疾病個體的可行性。

①MiRNA：MiRNA通過結合靶mRNA 3’-UTR，誘導mRNA降解或翻譯抑制[30]，導致靶基因的轉錄后沉默，調(diào)節(jié)靶基因表達，參與腫瘤增殖、凋亡和轉移過程。胰腺癌細胞與正常胰腺導管上皮細胞中miRNA表達譜不同，表明外泌體miRNA可作為可靠的胰腺癌生物學標志物。Que等[31]通過RT-PCR技術檢測49例患者血清miRNA，結果顯示胰腺癌細胞來源的外泌體中高表達miR-17-5p和miR-21，可用于鑒別胰腺癌和胰腺良性腫瘤。Nakamura等[32]通過超速離心法分離胰腺癌和慢性胰腺炎患者的胰液，結果顯示胰腺癌患者外泌體miR-21和mi-R155表達顯著高于慢性胰腺炎患者(P均<0.05)，結合胰液細胞學可將診斷準確性升至91%。然而，miR-21在其他惡性腫瘤(包括胃癌、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌和肝癌)中亦高表達，故其鑒別胰腺癌與其他腫瘤的臨床價值極具爭議[9]。Lai等[27]發(fā)現(xiàn)胰腺癌血漿外泌體miR-10b、miR-21、miR-30c和miR-181a高表達，而外泌體miR-let7a低表達，能區(qū)分胰腺癌與對照組，且胰腺癌患者切除胰腺24 h內(nèi)外泌體中高表達的四種miRNA降至正常水平，表明血漿外泌體miRNA是診斷胰腺癌的潛在生物學標志物。

②CircRNA：CircRNA的主要作用之一是結合功能性miRNA調(diào)控基因的表達，circRNA在物種間的高豐度、相對穩(wěn)定性、半衰期長和進化的保守性使其成為許多疾病尤其是癌癥的潛在生物學標志物[33]。Li等[34]證實circRNA IARS在外泌體中富集并穩(wěn)定存在，在胰腺癌組織和轉移性腫瘤血漿外泌體中的表達上調(diào)，并可增加血管內(nèi)皮細胞通透性，促進腫瘤侵襲和轉移，表明外泌體circRNA有望成為胰腺癌早期診斷和預后監(jiān)測的循環(huán)生物學標志物。有研究[35]通過微陣列分析從肝轉移性胰腺癌細胞外泌體中鑒別出circRNA PDE8A，可通過促進上皮-間質轉化介導胰腺癌細胞的侵襲性生長，其高表達與胰腺癌患者的病情進展和預后相關，有望成為胰腺癌的生物學標志物。

3.外泌體多參數(shù)分析：綜合分析多個外泌體的生物學標志物可提高敏感性和特異性，有助于胰腺癌的早期診斷。Madhavan等[36]通過流式細胞儀檢測出血清胰腺癌起始細胞外泌體蛋白質標志物(CD44v6、Tspan8、EpCAM、MET和CD104)，采用qRT-PCR方法鑒定出4種較非胰腺惡性腫瘤對照組表達明顯上調(diào)的miRNA(miR-1246、miR-4644、miR-3976和miR-4306)，兩者聯(lián)合診斷胰腺癌的敏感性和特異性分別為100%和80%。Xiao等[37]聯(lián)合外泌體GPC1、CD82和CA19-9診斷胰腺癌的ROC曲線下面積達0.942，可有效區(qū)分健康人與胰腺癌患者以及胰腺炎與胰腺癌患者。目前外泌體單變量分析極大地限制了診斷的敏感性和特異性，需充分利用外泌體包含腫瘤細胞集合參數(shù)的優(yōu)勢，進行外泌體多參數(shù)分析，以提高診斷的準確性。

三、小結與展望

胰腺癌是一種復雜的侵襲性疾病，由于缺乏有效的早期診斷方法而預后極差。理想的胰腺癌診斷方法應可明確局部良惡性病變，并能早期檢測良性腫瘤和癌前病變，如胰腺上皮內(nèi)瘤變(PanINs)和具有進展風險的囊性黏液性病變。隨著對微創(chuàng)診斷和治療的重視，外泌體標志物作為非侵入性方法在胰腺癌的早期診斷、實時監(jiān)測病情進展和治療效果以及判斷預后方面的臨床價值受到越來越多的關注。然而，外泌體廣泛存在于包含大量非囊泡大分子結構的體液中，分離純化方法差異較大，將其作為胰腺癌早期診斷方法應用于臨床，仍需行大規(guī)模多中心實驗，建立標準化且簡單易操作的分離純化技術。外泌體分離新方法的出現(xiàn)以及高通量二代測序技術應用于外泌體檢測，可大大提高外泌體生物學標志物早期診斷胰腺癌的準確性。未來需進一步研究來探索外泌體的潛在臨床應用，這將會開啟胰腺癌診療的新時代。