■王賀澤 丁宏標(biāo) 李習(xí)龍 畢研亮

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081）

植物色素主要有類胡蘿卜素、葉黃素、花青素、姜黃素、葉綠素等，它們是主要起著色作用的植物次生代謝物，同時(shí)還具有抗氧化等多種活性[1]。葉綠素是一種雙羧酸的酯，其中一個(gè)羧基被甲醇所酯化，另一個(gè)羧基被葉綠醇所酯化，頭部含有一個(gè)卟啉環(huán)，有極性，尾部是葉綠醇（植醇）。葉綠素是高等植物、藻類、細(xì)菌進(jìn)行光合作用的主要色素，可以分為葉綠素a、b、c、d、f 以及原葉綠素和細(xì)菌葉綠素等，其中葉綠素a 和葉綠素b 是高等植物葉綠體中主要的葉綠素。

早在1940 年，Gruskin[2]研究發(fā)現(xiàn)葉綠素可以用來(lái)治療胃腸道疾病、癌癥、貧血。在1998 年，Kiyoka等[3]發(fā)現(xiàn)綠茶中的葉綠素a 和葉綠素b 對(duì)12-氧-十四烷酰佛波醇-13-醋酸酯（TPA，12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate）誘導(dǎo)的腫瘤呈劑量依賴性抑制作用。Huws 等[4]發(fā)現(xiàn)了原生動(dòng)物中多不飽和脂肪酸的含量與葉綠體有關(guān)。植烷酸的含量和葉綠素的含量有關(guān)，青綠飼料中富含葉綠素，有研究表明與飼喂混合日糧相比，飼喂青綠飼料奶牛的牛奶中的植烷酸含量從150 mg/100 g增加到450 mg/100 g[5]。近來(lái)也有越來(lái)越多的研究表明葉綠素與動(dòng)物和人類的健康密切相關(guān)，Xie 等[6]發(fā)現(xiàn)葉綠素可以促進(jìn)小鼠肝臟和腎臟中鉛的排泄，減少鉛的積累。Suparmi等[7]發(fā)現(xiàn)給小鼠注射葉綠素可以提高血紅蛋白和鐵蛋白水平，有可能治療溶血性貧血。但是目前關(guān)于葉綠素的研究還很少，本文旨在對(duì)葉綠素的專利技術(shù)進(jìn)行分析和總結(jié)，為葉綠素的進(jìn)一步研究提供了參考。

1 專利申請(qǐng)情況

利用中外文數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了近年來(lái)與葉綠素相關(guān)的專利申請(qǐng)情況，并且對(duì)其進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。1960年，美國(guó)最先申請(qǐng)了從木瓜中回收葉綠素方法的專利，而1985 年我國(guó)首次申請(qǐng)葉綠素從蠶沙中提取的專利。通過(guò)對(duì)2010 年至2018 年專利申請(qǐng)數(shù)量的分析，發(fā)現(xiàn)與葉綠素有關(guān)的專利申請(qǐng)量每年持續(xù)上升，表明研究者對(duì)本領(lǐng)域的關(guān)注度越來(lái)越高。從不同國(guó)家專利申請(qǐng)量來(lái)看，中國(guó)雖然申請(qǐng)時(shí)間較晚，但是申請(qǐng)量位居第一，約占47%，說(shuō)明近年我國(guó)在葉綠素方面的研究不斷取得新的進(jìn)展。

通過(guò)對(duì)已經(jīng)公布的專利分析發(fā)現(xiàn)，專利申請(qǐng)主要集中于以下幾個(gè)領(lǐng)域：葉綠素提取和純化的方法、葉綠素及其衍生物的應(yīng)用、檢測(cè)葉綠素含量的方法及裝置等，其中前兩者專利申請(qǐng)數(shù)量較多，近年來(lái)已經(jīng)成為熱門的研究方向。

2 葉綠素來(lái)源

葉綠素廣泛存在于綠色植物中，生產(chǎn)中用于提取葉綠素的原料主要有蠶沙（蠶的糞便）、蔬菜、小球藻、植物葉片等，其中小球藻是自然界中葉綠素含量最高的生物，大約為4%～6%。而目前國(guó)內(nèi)工業(yè)上提取葉綠素大部分使用蠶沙，蠶絲業(yè)是我國(guó)的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)，每年蠶的養(yǎng)殖量不斷增加，因此蠶沙產(chǎn)量很大，但是大部分蠶沙沒(méi)有得到充分的利用，僅僅用作肥料、飼料。蠶沙便宜易得，而且葉綠素含量很高，利用蠶沙不僅可以得到富含葉綠素的產(chǎn)品，使用過(guò)的蠶沙還可以繼續(xù)用作肥料，這樣使蠶沙得到了合理充分地利用，提高了其經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是蠶沙也存在一些缺點(diǎn)：原料比較分散、容易受季節(jié)和天氣的限制等。

3 葉綠素提取方法

近年隨著研究的深入和技術(shù)的發(fā)展，研究者發(fā)明了多種提取方法，使葉綠素提取工藝流程不斷地得到完善。

3.1 有機(jī)溶劑萃取

有機(jī)溶劑萃取是傳統(tǒng)提取葉綠素常用的方法，主要工藝流程包括浸提、濃縮、洗滌、干燥等，最常用的有機(jī)溶劑有石油醚、乙醇、丙酮等。例如1992 年，公開(kāi)號(hào)為CN1063704 的專利采用有機(jī)溶劑萃取的方法從竹葉中獲得葉綠素液[8]，這種方法操作復(fù)雜，提取速度較慢，耗時(shí)比較長(zhǎng)，葉綠素容易受到破壞，提取的葉綠素純度不高，而且有機(jī)溶劑成本高、毒性大，殘留的溶劑還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。

3.2 超臨界流體萃取

公開(kāi)號(hào)CN101648955 利用超臨界流體萃取葉綠素的方法[9]，其是在室溫條件下利用無(wú)色、無(wú)味、無(wú)毒的CO2作為提取介質(zhì)進(jìn)行萃取，這種方法通過(guò)改變溫度和壓力就可以使溶劑在超臨界CO2流體中的溶解度大幅度改變，從而為物質(zhì)的提取提供了更多的可能。與傳統(tǒng)提取方法相比，超臨界流體萃取極大地簡(jiǎn)化了生產(chǎn)流程，提高了生產(chǎn)效率，而且CO2不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，價(jià)格較低，可以循環(huán)使用，大大降低了生產(chǎn)成本。

3.3 超聲波提取

超聲波提取是近來(lái)應(yīng)用越來(lái)越廣泛的一種方法，超聲波可以破碎細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的釋放，縮短提取時(shí)間。例如公開(kāi)號(hào)CN103145718A 使用了超聲波提取葉綠素，在短時(shí)間內(nèi)獲得了大量的葉綠素，并且發(fā)現(xiàn)超聲波時(shí)間為15 min 時(shí)葉綠素含量最高[10]。公開(kāi)號(hào)CN106854209A 將振蕩提取、超聲波提取、振蕩結(jié)合超聲波提取三種方式進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方式聯(lián)合起來(lái)提取的葉綠素含量最高[11]。

3.4 其他提取方法

公開(kāi)號(hào)CN1078750，該專利將水作為溶劑，通過(guò)結(jié)合酶工程技術(shù)，從蠶沙中制取葉綠酸鹽[12]，極大地降低了生產(chǎn)成本，節(jié)約了資源，同時(shí)減少了生產(chǎn)設(shè)備的資金投入。公開(kāi)號(hào)CN1634920、CN102093369A 在提取葉綠素前，增加了微波預(yù)處理的工藝，破壞了組織細(xì)胞，使提取時(shí)間和有機(jī)溶劑使用量大大減少，提高了提取效率，使葉綠素提取工藝得到了一定的改善[13-14]。公開(kāi)號(hào)CN102206221A 使用無(wú)機(jī)堿法提取葉綠素[15]，相對(duì)于超臨界流體萃取成本較低，而且獲得的產(chǎn)品中不會(huì)殘留有機(jī)溶劑。 公開(kāi)號(hào)CN103641837A 采取酶解法[16]，使用酶將原料中的大分子物質(zhì)進(jìn)行酶解，在較短的時(shí)間內(nèi)可以提取大量的葉綠素。

4 葉綠素及其衍生物的應(yīng)用

葉綠素極不穩(wěn)定，光、熱、酸、堿等一些理化因素都會(huì)使其分解，因此在提取過(guò)程中容易使葉綠素受到破壞，這給葉綠素的應(yīng)用帶來(lái)了很大的困難，所以常常制成葉綠酸鹽后應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、保健等方面，不僅保留了葉綠素原有的卟啉環(huán)結(jié)構(gòu)，保持了綠色，而且提高了其穩(wěn)定性和水溶性，有利于葉綠素更廣泛的應(yīng)用。生產(chǎn)中通常將葉綠素浸提液或葉綠素浸膏通過(guò)皂化、酸化等一系列步驟，用銅、鋅等其他金屬元素代替葉綠素中的鎂離子來(lái)制取葉綠素衍生物。

4.1 食品添加劑

在食品加工過(guò)程中通常會(huì)通過(guò)添加色素來(lái)改善食品的色澤，目前市場(chǎng)上色素主要包括天然色素和合成色素兩種，合成色素中含有苯環(huán)等許多對(duì)人體有害的基團(tuán)，攝入量過(guò)多，對(duì)人體有很大的危害，目前一些國(guó)家已經(jīng)禁止使用合成色素。而天然色素是從天然資源中提取的色素，安全、無(wú)毒副作用，深受廣大消費(fèi)者的青睞。例如公開(kāi)號(hào)CN103509028A 使用傳統(tǒng)的葉綠素提取方法，再進(jìn)行銅代制備了葉綠素銅鈉鹽，可以作為食品的著色劑，用于糕點(diǎn)、糖果等食品中改善其色澤[17]。

4.2 保健治病

葉綠素衍生物對(duì)人體有許多益處，可以抗腫瘤、抗菌、促進(jìn)傷口愈合、保護(hù)肝臟、治療貧血等疾病。缺鐵是全世界最普遍的微量營(yíng)養(yǎng)素缺乏，卟啉鐵是營(yíng)養(yǎng)學(xué)家普遍認(rèn)為治療貧血的最有效的鐵源。例如，公開(kāi)號(hào)CN104370923A 用二價(jià)鐵離子代替鎂離子，制備了葉綠素鐵鋅鹽[18]，公開(kāi)號(hào)CN101671341 利用富含葉綠素的原料和硫酸亞鐵制備鐵葉綠素[19]，可以促進(jìn)血紅蛋白的合成，對(duì)治療缺鐵性貧血和再生障礙性貧血有顯著的效果。葉綠素對(duì)鐵的調(diào)節(jié)有雙重作用，公開(kāi)號(hào)CN106902111A 發(fā)現(xiàn)葉綠素還可以促進(jìn)鐵的排泄，防止鐵過(guò)載造成的肝臟、腎臟損傷，而且無(wú)副作用[20]。公開(kāi)號(hào)CN1406940 發(fā)明了葉綠素鉻的制備方法，制造出了具有生物活性的葉綠素鉻[21]，其操作簡(jiǎn)便、成本極低、毒性較低，可用于治療糖尿病、新生兒黃疸等疾病。公開(kāi)號(hào)CN102199153A 制備的葉綠素銅鈉鹽在醫(yī)藥上得到了廣泛的應(yīng)用，不僅可以用作食品添加劑、著色劑，還具有抗癌、抗氧化、抗腫瘤等作用[22]。公開(kāi)號(hào)CN110090210A 發(fā)現(xiàn)給存在急性微循環(huán)障礙的動(dòng)物注射葉綠素衍生物，血流灌注量、血細(xì)胞聚集程度、血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速率都有所下降[23]，這表明葉綠素衍生物對(duì)改善腸系膜微循環(huán)障礙有明顯的效果。

4.3 飼料添加劑

目前使用的飼料中添加了許多化學(xué)物質(zhì)、人工合成物質(zhì)等，這些成分會(huì)對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和內(nèi)分泌產(chǎn)生不利的影響，其中一些有害的化學(xué)成分還會(huì)隨著人們的食用進(jìn)入人體內(nèi)，從而危害人體的健康。公開(kāi)號(hào)CN101318963A 將從劍、蕃麻葉中提取的葉綠素直接作為飼料添加劑[24]，不僅充分利用了劍、蕃麻葉原料，而且減少了麻渣對(duì)環(huán)境的污染。公開(kāi)號(hào)CN106578367A 制備了適用于多類飼料的葉綠酸鹽[25]，不僅天然、無(wú)毒副作用，而且可以提高動(dòng)物的免疫力，促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，改善畜產(chǎn)品的品質(zhì)。隨著近來(lái)食品安全事件的頻繁出現(xiàn)，人們對(duì)畜產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)注度也越來(lái)越高。畜禽的肌纖維數(shù)量、肌氨酸和硫胺素含量等都會(huì)影響畜禽肉品質(zhì)、風(fēng)味、口感。公開(kāi)號(hào)CN106632359A 從桑葉渣中提取了脫鎂葉綠素，并將其和富馬酸亞鐵等物質(zhì)結(jié)合使用后，減小了肌纖維的直徑，增加了肌氨酸和硫胺素含量，從而改善了肉品質(zhì)、風(fēng)味、口感[26]。公開(kāi)號(hào)CN107912606A 在半干青貯飼料中添加葉綠素銅鈉鹽，有利于維持動(dòng)物腸道菌群的平衡[27]。公開(kāi)號(hào)CN105995142A 發(fā)現(xiàn)在鴨飼料中添加菠菜葉綠素，鴨的產(chǎn)蛋率提高了34.56%，而且鴨蛋品質(zhì)也得到了改善[28]。

4.4 其他作用

葉綠素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于日常用品中，例如，公開(kāi)號(hào)CN107325106A 利用紅豆杉制備了葉綠素浸膏用于化妝行業(yè)中，具有美容養(yǎng)顏、抗皺、抗衰老的功效[29]。公開(kāi)號(hào)CN101559031 首次發(fā)明了富含葉綠素銅鈉的新型花露水[30]，無(wú)毒，無(wú)刺激，不僅可以驅(qū)蚊止癢，還有提高免疫力，抗?jié)兊茸饔?。近幾年還有許多專利發(fā)明了含有葉綠素的牙膏，具有祛除口臭、殺菌消炎、除菌斑、保護(hù)牙齒健康的功效。

5 小結(jié)

隨著科研工作者不斷深入地研究，葉綠素的提取方法不斷得到改善，而且有越來(lái)越多的研究者將葉綠素作為飼料添加劑研究其對(duì)動(dòng)物機(jī)體的作用。開(kāi)發(fā)天然色素不僅可以充分地利用自然資源，降低生產(chǎn)成本，還可以減少環(huán)境污染，同時(shí)青綠飼料中含有豐富的葉綠素，但是養(yǎng)殖行業(yè)趨向于集約化大規(guī)模發(fā)展，使青綠飼料使用量大大減少，開(kāi)發(fā)葉綠素可以避免飼料添加劑的過(guò)度使用，從而生產(chǎn)出綠色健康的畜產(chǎn)品。但是目前還有以下幾個(gè)方面有待進(jìn)行研究：葉綠素作為飼料添加劑的最佳添加水平；葉綠素對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)性能及其他方面的影響；葉綠素在動(dòng)物機(jī)體的作用途徑和機(jī)制。因此對(duì)于葉綠素還需要做進(jìn)一步的研究，以最大限度地發(fā)揮葉綠素在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用潛力。