■車常寶 石 勇 胡 毅 鐘 蕾

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院湖南省特色水產(chǎn)資源利用工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙410128）

穿心蓮內(nèi)酯（Andrographolide），是從爵床科草本穿心蓮[Andrographis panicultata（Burm.f）]全草中提取的主要有效成分[1]，Zhou等[2]、Lee等[3]和Wong等[4]表明穿心蓮內(nèi)酯具有治療病毒感染、抗炎和抗癌作用。給每千克魚體投喂10～30 mg/d 黃芪多糖可增強(qiáng)草魚（Ctenopharyngodon idella）[5]非特異性免疫功能。在飼料中添加1 g/kg三丁酸甘油酯[6]、0.4%甘露寡糖[7]能分別促進(jìn)建鯉（Cyprinus carpiovar Jian）、鰻鱺（Anguilla anguilla）生長(zhǎng)、增強(qiáng)腸道消化酶活性和提高魚體非特異性免疫力；適宜劑量的膽汁酸、牛磺酸能提高水產(chǎn)動(dòng)物氧化能力，調(diào)節(jié)牛蛙（Ranacatesbeiana）[8]肝臟脂類代謝水平，減輕鯉魚（Cyprinus carpio）[9]的脂質(zhì)過(guò)氧化作用。有關(guān)研究顯示，投喂由甘露聚糖、β-葡聚糖組成的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑相比單獨(dú)投喂能進(jìn)一步提高刺參（Apostichopus japonicus）[10]的生長(zhǎng)率、非特異性免疫酶活性，且其持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)；0.2%黃芪多糖、人參莖葉皂苷、綠原酸、生物堿和黃酮等5 種配比的復(fù)方中草藥免疫增強(qiáng)劑能夠提高鯉魚[11]增重率和降低飼料系數(shù)，促進(jìn)鯉魚的生長(zhǎng)和提高魚體非特異性免疫。

黃鱔(Monopterus albus)，亦稱鱔魚，目前我國(guó)黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)量已達(dá)30萬(wàn)噸[12]，產(chǎn)值超過(guò)210億元。近年來(lái)我國(guó)養(yǎng)殖量不斷加大，使得疾病狀況日趨嚴(yán)重，同時(shí)抗生素的大量使用使得黃鱔抗病力下降，給養(yǎng)殖戶造成嚴(yán)重的損失[13]。

本試驗(yàn)利用不同免疫增強(qiáng)劑之間的協(xié)同作用，通過(guò)合理的配比，有選擇性的將幾種免疫增強(qiáng)劑搭配使用，旨在研究以穿心蓮內(nèi)酯為主的黃鱔水產(chǎn)復(fù)合免疫增強(qiáng)劑，替代抗生素，促進(jìn)魚類生長(zhǎng)，增強(qiáng)魚體免疫力，提高魚類抗病、防病能力和抗逆性，以期為水產(chǎn)動(dòng)物免疫增強(qiáng)類添加劑替代抗生素的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

穿心蓮內(nèi)酯（純度98%，購(gòu)于湖南佳瑞思生物科技有限公司）、三丁酸甘油酯（購(gòu)于青島柯能生物科技有限公司）、膽汁酸（購(gòu)于山東龍昌動(dòng)物科技有限公司）、甘露寡糖（購(gòu)于青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司）、黃芪多糖（購(gòu)于四川省環(huán)亞生物科技有限公司）、?；撬幔ㄙ?gòu)于源葉生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)飼料

以黃鱔商品飼料為基礎(chǔ)，配制出一種以魚粉、豆粕、玉米蛋白粉和大豆?jié)饪s蛋白為蛋白源，魚油為脂肪源的基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。復(fù)配1（F1，基礎(chǔ)飼料+0.05%穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯0.05%+膽汁酸0.02%+甘露寡糖0.04%）、復(fù)配2（F2，基礎(chǔ)飼料+0.05%穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯0.05%+黃芪多糖0.05%+?；撬?.02%）。飼料原料經(jīng)先粉碎過(guò)60 目篩網(wǎng)，再按配比從小到大逐級(jí)定量均勻混合，再將其進(jìn)入V 型攪拌機(jī)充分混合25 min，隨后將魚油與已混好的干粉充分混勻，飼料風(fēng)干后置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?，投喂前?0%水調(diào)成面團(tuán)狀使用。

1.3 飼養(yǎng)與管理

養(yǎng)殖試驗(yàn)在湖南省常德市西湖鎮(zhèn)黃鱔實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，通過(guò)池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖方式進(jìn)行試驗(yàn)，放入網(wǎng)箱后停食48 h，用蚯蚓和魚漿進(jìn)行前期馴化，馴養(yǎng)到能夠正常攝食全魚漿。后期馴化投喂飼料與魚漿混合物(比例1∶4)，根據(jù)攝食情況提高飼料的比例，直至黃鱔完全攝食飼料，整個(gè)馴化時(shí)間約為15 d，停食24 h后，挑選初始體重為(25.00±0.05) g 的黃鱔隨機(jī)分成3 組，每組3個(gè)重復(fù)，共9個(gè)網(wǎng)箱(1.5 m×2.0 m×1.0 m)，每個(gè)網(wǎng)箱飼養(yǎng)60 尾黃鱔。日投喂1 次(17:00～18:00)，投喂量為黃鱔體重的3%～5%，每星期調(diào)整一次投喂量，養(yǎng)殖時(shí)間持續(xù)56 d。

1.4 樣品采集

養(yǎng)殖56 d后，禁食24 h，分別取出各網(wǎng)箱的黃鱔，稱量總重并記錄尾數(shù)，每個(gè)網(wǎng)箱采集5 尾魚，用2 ml注射器尾靜脈取血，將血液混合并置于無(wú)菌離心管中，4 ℃靜置過(guò)夜，3 000 r/min 離心10 min，取上層血清置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；取魚體肝臟保存于-80 ℃冰箱備用；分別取魚體肝臟、腸道組織于1.5 ml無(wú)RNA酶管中，封口膜封口后置于液氮中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.5 指標(biāo)測(cè)定方法

1.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo)

試驗(yàn)起始和結(jié)束時(shí)分別對(duì)各網(wǎng)箱黃鱔進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重計(jì)算特定生長(zhǎng)率、增重率、成活率和餌料系數(shù)。

特定生長(zhǎng)率(SGR，%/d)=（lnW2-lnW1）×100/t

增重率(WGR，%)=(W2-W1)/W1×100

存活率(SR，%)=(N1-N2)/N1×100

餌料系數(shù)（FCR）=F/（W2-W1）

式中：W1——試驗(yàn)開始時(shí)黃鱔總重(g)；

W2——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)黃鱔總重(g)；

t——飼養(yǎng)天數(shù)(d)；

F——餌料攝入量(g)；

N1——試驗(yàn)魚初始尾數(shù)；

N2——試驗(yàn)魚結(jié)束尾數(shù)。

試驗(yàn)結(jié)束后每網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾黃鱔，記錄體長(zhǎng)和體重，解剖取內(nèi)臟并分離肝臟稱重，計(jì)算肝體比、臟體比和肥滿度。

肝體比（HSI，%）=肝臟重/體重×100

臟體比（VSI，%）=內(nèi)臟重/體重×100

肥滿度（CF，%）=體重（g）/[體長(zhǎng)（mm）]3×100

1.5.2 體成分

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取5尾黃鱔用于體成分檢測(cè)。其中水分含量的測(cè)定采用105 ℃烘箱干燥恒重法，粗蛋白含量的測(cè)定采用凱氏定氮法，粗脂肪含量的測(cè)定采取索氏抽提法，粗灰分含量的測(cè)定采用550 ℃灼燒法。

1.5.3 酶活性指標(biāo)

血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(AKP)、葡萄糖（GLU）、總膽汁酸（TBA）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）以及腸道脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶按照從南京建成生物工程研究所訂購(gòu)的試劑盒的要求進(jìn)行檢測(cè)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及肝臟中谷胱甘肽（GSH）、總抗氧化能力（TAOC）按照從南京建成生物工程研究所訂購(gòu)的試劑盒的要求進(jìn)行檢測(cè)；血清免疫球蛋白M(IgM)、補(bǔ)體4(C4)指標(biāo)按照從浙江伊利康生物技術(shù)有限公司訂購(gòu)的試劑盒的要求進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS20.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（mean±SE）表示，先對(duì)數(shù)據(jù)做單因素方差分析（One-way ANOVA），若組間差異顯著，再用Duncan's法多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔生長(zhǎng)性能的影響(見(jiàn)表2)

表2 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔生長(zhǎng)性能的影響

由表2可知，F(xiàn)1、F2組的餌料系數(shù)顯著低于F0組（P＜0.05），而增重率、特定生長(zhǎng)率則與之相反；各組肝體比、臟體比、肥滿度均低于F0 組，但與F0 組相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在復(fù)配組之間，F(xiàn)1組的增重率、特定生長(zhǎng)率、肝體比、臟體比最高，F(xiàn)2 組次之，而存活率、肥滿度與之相反。

2.2 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔腸道消化酶活性的影響（見(jiàn)表3）

表3 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔腸道消化酶活性的影響

由表3 可知，F(xiàn)1、F2 組黃鱔腸道胰蛋白酶活性顯著高于F0 組，但F1、F2 組之間差異不顯著。與F0 組相比，F(xiàn)2組淀粉酶活性顯著高于F0組（P＜0.05），F(xiàn)1組與F0、F2組差異不顯著（P＞0.05）；F1組脂肪酶活性顯著高于F0 組（P＜0.05），但F2 組與F0 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.3 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔體成分的影響（見(jiàn)表4）

表4 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔體成分的影響(%)

由表4 可知，各組黃鱔粗灰分含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與F0 組相比，F(xiàn)1 組和F2 組粗蛋白含量顯著升高（P＜0.05）；F1組粗脂肪含量顯著低于F0組（P＜0.05），但F2組與F0組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.4 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔血清免疫相關(guān)酶活性的影響（見(jiàn)表5）

表5 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔血清免疫相關(guān)酶活性的影響

由表5 可知，各組黃鱔血清中IgM 含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與F0 組相比，F(xiàn)1 組和F2 組血清中SOD活性顯著升高（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.05）；F1組血清中CAT活性顯著升高（P＜0.05），C4含量和AKP 活性顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)2 組與F0 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

2.5 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔肝臟抗氧化能力的影響（見(jiàn)表6）

由表6可知，各組黃鱔肝臟CAT含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與F0組相比，F(xiàn)1組和F2組GSH含量顯著升高（P＜0.05），MDA 含量顯著降低（P＜0.05）；F1 組肝臟SOD活性顯著升高（P＜0.05），T-AOC含量顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)2組與F0組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

表6 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔肝臟抗氧化能力的影響

2.6 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔血清生化指標(biāo)的影響（見(jiàn)表7）

表7 復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔血清生化指標(biāo)的影響

由表7可知，各組黃鱔血清AST活性、GLU、TBA、TC 含量無(wú)顯著影響（P＞0.05）。與F0 組相比，F(xiàn)1 組和F2 組ALT 活性、LDL 含量顯著降低（P＜0.05）；F1 組血清HDL含量顯著低于F0組（P＜0.05），F(xiàn)2組與F0組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔生長(zhǎng)性能的影響

本研究中，黃鱔基礎(chǔ)飼料中添加以穿心蓮內(nèi)酯為主的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑均能提高黃鱔增重率、特定生長(zhǎng)率、腸道消化酶活性，降低餌料系數(shù)，提高黃鱔生長(zhǎng)性能。這與翟秋玲等[14]在菊黃東方鲀基礎(chǔ)飼料中添加50 mg/kg 三丁酸甘油酯+250 mg/kg 甘露寡糖可維護(hù)菊黃東方鲀的腸道健康，增強(qiáng)腸道消化酶活力，提高飼料效率和生長(zhǎng)性能；Bo Liu 等[15]研究表明甘露寡糖可以提高異育銀鯽的存活率、生長(zhǎng)性能；牛志偉[16]通過(guò)Meta 分析法表明甘露寡糖具有提高魚類、南美白對(duì)蝦、海參的增重率和特定增長(zhǎng)率，可以顯著降低魚類的餌料系數(shù)；杜宗君等[17]研究表明在飼料中添加200、400 mg/kg 甘露寡糖，可顯著提高泥鰍的特定生長(zhǎng)率和肥滿度，降低了餌料系數(shù)，促進(jìn)泥鰍的生長(zhǎng)研究相似。同時(shí)，在唐啟峰等[18]、Hou 等[19]的研究中發(fā)現(xiàn)，三丁酸甘油酯均能提高養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)性能。同時(shí)，本試驗(yàn)中F1、F2組粗脂肪均低于F0組，粗蛋白均高于F0 組，表明以上兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑均能提高蛋白質(zhì)的利用以及促進(jìn)脂肪的消化吸收。由表2、表3、表4可知，在提高生長(zhǎng)性能方面，F(xiàn)1組效果更好，這可能是由于F1 組免疫增強(qiáng)劑的協(xié)同效果更優(yōu)于F2 組，也有可能是前者添加的單一免疫增強(qiáng)劑配比更佳。

3.2 兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑對(duì)黃鱔血清、肝臟生化及免疫功能的影響

AST是一種重要的氨基轉(zhuǎn)移酶，活性的變化也是反映肝細(xì)胞受到損傷的主要敏感指標(biāo)。正常情況下，動(dòng)物的血清中只含有微量的AST，當(dāng)血清中AST的活性升高或組織內(nèi)AST的活性降低時(shí)，即表明動(dòng)物機(jī)體的肝臟、心臟等內(nèi)臟器官發(fā)生損傷[20]。ALT 廣泛存在于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)，是機(jī)體內(nèi)中間代謝的重要反應(yīng)酶，在機(jī)體蛋白質(zhì)代謝中起主要作用，其活性也是反映肝細(xì)胞受損傷的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，F(xiàn)1、F2組AST 活力略低于F0組，而ALT活力則顯著低于F0組，且復(fù)配組之間AST、ALT 活力差異不顯著，以上表明添加的兩種復(fù)合免疫增強(qiáng)劑均可保護(hù)肝細(xì)胞不受損害，增強(qiáng)對(duì)機(jī)體的保護(hù)功能。血清TC可反映機(jī)體脂肪代謝的總體情況。本試驗(yàn)中，F(xiàn)I、F2組復(fù)合免疫增強(qiáng)劑較F0組有降低血清TC 含量的能力。有研究表明，一定劑量的果寡糖可降低異育銀鯽的血清膽固醇和甘油三脂的含量[21]；在飼料中添加果寡糖和甘露寡糖，降低了大菱鲆幼魚血清總膽固醇和甘油三酯含量[22]，以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果類似，同時(shí)，復(fù)配組黃鱔魚體粗脂肪含量、血清LDL含量均低于F0組，表明甘露寡糖可通過(guò)降低魚體血清TC、LDL 含量、魚體粗脂肪來(lái)調(diào)節(jié)脂類代謝，寡糖具有調(diào)節(jié)動(dòng)物血清中生化指標(biāo)和改善動(dòng)物健康狀況的功能。

AKP是魚類代謝過(guò)程中重要的調(diào)控酶，可以催化磷酸單酯的水解及磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，對(duì)機(jī)體非特異性免疫也發(fā)揮著重要作用，AKP活性的高低可以用來(lái)判斷魚類非特異性免疫機(jī)能的強(qiáng)弱[23]。免疫球蛋白因其具有結(jié)合抗原、激活補(bǔ)體和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等生物學(xué)功能，且能夠反映出機(jī)體的免疫水平，甚至能夠直觀地反映免疫組織器官的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能的變化[24]。本試驗(yàn)中，F(xiàn)2 組AKP 含量略低于F0 組，F(xiàn)1組顯著低于F0 組，這與徐磊等[25]研究表明連續(xù)投喂240、480 mg/kg甘露寡糖組能顯著提高異育銀鯽AKP活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同，這可能是同種免疫增強(qiáng)劑添加對(duì)象、添加劑量或者復(fù)配形式不同，其使用效果也有一定差異。

SOD在抗氧化酶系統(tǒng)中起防御作用，可催化超氧陰離子自由基的歧化反應(yīng)；MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)鏈終止階段產(chǎn)生的小分子物質(zhì)，它的變化趨勢(shì)可以間接反映動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力強(qiáng)弱；T-AOC反映機(jī)體對(duì)外來(lái)刺激的抵抗能力及體內(nèi)自由基代謝狀態(tài)，它是反映動(dòng)物機(jī)體氧化應(yīng)激的典型指標(biāo)[26]。有研究表明，穿心蓮內(nèi)酯在外周組織中具有抗炎和抗氧化活性[27]，可降低CNS 中氧化應(yīng)激[28]，也可能通過(guò)上調(diào)Nrf2，一種抗氧化反應(yīng)的主調(diào)節(jié)因子，對(duì)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞具有抗氧化作用[29]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)飼料中添加以穿心蓮內(nèi)酯為主不同配比的免疫增強(qiáng)劑均能提高黃鱔的血清非特異性免疫能力，表現(xiàn)為F1、F2組黃鱔血清SOD 活性均顯著高于F0 組以及MDA 含量顯著低于F0 組。Sani 等[30]研究表明穿心蓮內(nèi)酯下調(diào)促炎細(xì)胞因子和自由基產(chǎn)生，艾春漢等[31]研究表明將穿心蓮浸膏粉添加到羅非魚飼料中，可顯著降低其肝臟中MDA含量，并顯著提高其血清中SOD活力，本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，這表明穿心蓮內(nèi)酯可增強(qiáng)黃鱔機(jī)體免疫力。F1 組黃鱔血清、肝臟SOD 活力、CAT含量均高于F0組，與于朝磊等[32]發(fā)現(xiàn)甘露寡糖可顯著提高半滑舌鰨稚魚的超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶活力研究結(jié)果一致，這可能是甘露寡糖與動(dòng)物腸道的病原菌（如大腸桿菌、沙門氏菌、梭狀芽抱桿菌等）特異性結(jié)合，減少其與動(dòng)物腸道黏膜上皮細(xì)胞結(jié)合的機(jī)會(huì)，從而起到競(jìng)爭(zhēng)抑制的雙重營(yíng)養(yǎng)免疫作用。黃芪多糖具有提高SOD的表達(dá)，降低MAD的含量的作用，具有很強(qiáng)抗氧化活力[33]，在尼羅羅非魚[34]、黃顙魚[35]的基礎(chǔ)飼料中添加不同水平的黃芪多糖可以提高魚體超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性并有效地提高魚體的抗氧化能力，以上實(shí)驗(yàn)研究與本試驗(yàn)結(jié)果類似，這表明幾種免疫增強(qiáng)劑合理配比能夠明顯提高黃鱔機(jī)體抗氧化能力，有利于提高魚體抗病力。

另外，穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯+膽汁酸+甘露寡糖、穿心蓮內(nèi)酯+三丁酸甘油酯+黃芪多糖+?；撬釋?duì)投喂黃鱔生長(zhǎng)和抗氧化能力的影響表現(xiàn)出高度的一致性，因此，以上復(fù)合免疫增強(qiáng)劑投喂黃鱔對(duì)其抗氧化能力的提高，在一定程度上促進(jìn)了機(jī)體免疫機(jī)能的改變，繼而提高了黃鱔機(jī)體抗病力，可能是促進(jìn)其生長(zhǎng)的一個(gè)重要原因，但各組分在提高黃鱔非特異性免疫力過(guò)程中的作用及交互作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

免疫增強(qiáng)劑能提高水產(chǎn)動(dòng)物生長(zhǎng)性能，又能提高水產(chǎn)動(dòng)物的免疫力和抗病力的優(yōu)點(diǎn)，可以作為預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物疾病暴發(fā)的好產(chǎn)品。在本試驗(yàn)條件下，飼料中添加以穿心蓮內(nèi)酯為主的復(fù)合免疫增強(qiáng)劑能夠促進(jìn)黃鱔生長(zhǎng)性能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，其中F1 組效果更好，F(xiàn)2組次之，但各組分在提高黃鱔非特異性免疫力過(guò)程中的交互作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。