李培倫， 王繼隆， 魯萬橋， 唐富江， 劉 偉

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所， 黑龍江 哈爾濱 150070)

魚類性腺發(fā)育主要包括原始生殖細(xì)胞的發(fā)生、遷移、分化及配子形成等過程，性腺在發(fā)育成熟過程中受基因表達(dá)、魚體年齡、外界環(huán)境條件、餌料狀況等因素的影響[1-2]。魚類生殖內(nèi)分泌調(diào)控由下丘腦-垂體-性腺軸(HPG軸)控制，故HPG軸在魚類性腺發(fā)育過程中起主導(dǎo)調(diào)控作用[3-4]。魚類生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素主要包含促性腺激素釋放激素(GnRH)[如垂體激素促黃體生長激素(LH)、促卵泡素(FSH)]及性類固醇激素[如睪酮(T)、雌二醇(E2)]。DOROSHOV等[5]指出，下丘腦分泌GnRH調(diào)節(jié)垂體合成并釋放FSH和LH，而FSH和LH調(diào)節(jié)性腺生成的T和E2不僅可促進(jìn)性腺的發(fā)育成熟，還能通過負(fù)反饋作用抑制GnRH的合成。性腺發(fā)育是硬骨魚類繁殖行為的重要體現(xiàn)，亦是魚體與外界環(huán)境相協(xié)調(diào)的表現(xiàn)，通過研究性腺的生長發(fā)育、組織結(jié)構(gòu)及其調(diào)控因素，可以探討其不同時期的繁殖特性，進(jìn)而在養(yǎng)殖過程中對其生殖生理過程進(jìn)行適當(dāng)調(diào)控。

大麻哈魚(Oncorhynchusketa)屬鮭形目(Salmoniformes)、鮭科(Salmonidae)、大麻哈魚屬(Oncorhynchus)，俗稱大馬哈魚、大馬哈、秋鮭等，廣泛分布于北冰洋、北太平洋及其有出?？诘牡恿髦?，國內(nèi)分布于黑龍江、圖們江和綏芬河水系[6]。大麻哈魚在江河中出生、海洋中生長發(fā)育，性成熟群體返回其出生的淡水河流進(jìn)行產(chǎn)卵繁殖，為典型的溯河洄游型魚類，一生僅繁殖1次，繁殖后親體死亡[7]。近年來，由于人工捕撈強(qiáng)度過大、棲息地環(huán)境污染及產(chǎn)卵場所功能退化等因素，導(dǎo)致大麻哈魚資源儲量嚴(yán)重下降，故世界各國對其開展增殖放流以恢復(fù)種群資源，并從氣候變遷、生化遺傳及棲息地生境特征等方面展開相關(guān)研究[8-11]。目前，大麻哈魚規(guī)?；Ｋ斯ぴ鲳B(yǎng)殖技術(shù)探索處于起步階段，工廠規(guī)?；ＫB(yǎng)殖效果不佳，3齡魚出現(xiàn)腹水、食欲下降等狀況導(dǎo)致生長緩慢或死亡，有關(guān)養(yǎng)殖方面的報道僅在前期生長[12]、鹽度脅迫[13-14]等方面，而血清中與生殖相關(guān)的內(nèi)分泌激素水平及性腺發(fā)育方面未見報道。因此，通過測定大麻哈魚前期生長過程中血清生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素水平，觀察其性腺發(fā)育特征，深入了解大麻哈魚養(yǎng)殖過程中性腺發(fā)育的生理學(xué)過程及生殖內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制，以期為其繁殖生物學(xué)研究及人工養(yǎng)殖技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2齡、3齡大麻哈魚各42尾，生長狀況良好，于2016年10月采集于山東煙臺東方海洋股份有限公司。試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 MS-222麻醉劑麻醉魚體，測量其叉長(F，精確至0.1 cm)、體重(BW，精確至0.1 g)等生物學(xué)指標(biāo)；尾靜脈采血3～5 mL裝至離血管，室溫條件下冷卻1 h，4℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清，-20℃冰箱保存。最后解剖大麻哈魚，判斷性別并觀察性腺發(fā)育狀況，稱量性腺重(GW，精確至0.01g)和凈體重(NBW)，并測算性成熟系數(shù)(GSI)，最后將性腺在波恩試液中固定24 h后保存于70%酒精中，用于組織學(xué)觀察。

1.2.2 性激素測定 采用放射免疫分析技術(shù)(RIA)測定大麻哈魚血清中生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素，包含促性腺激素釋放激素(GnRH)、促黃體生長激素(LH)、促卵泡素(FSH)、睪酮(T)、雌二醇(E2)等5種激素。測定時嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 組織學(xué)觀察 性腺組織經(jīng)梯度酒精脫水、常規(guī)石蠟包埋、SLEE切片機(jī)切片(厚度6 μm)、常規(guī)HE染色、二甲苯透明，中性樹膠封片保存。用Carl Zeiss顯微鏡觀察組織切片，SZSS 2000顯微拍照系統(tǒng)拍照測量。卵母細(xì)胞發(fā)育分期參考龔啟祥等[15]的方法，精母細(xì)胞發(fā)育分期參考SCHULZ等[16]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPASS19.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大麻哈魚樣本生物學(xué)特征

從表1看出，2齡大麻哈魚在叉長、體重、凈體重、性腺重、性成熟系數(shù)等生物學(xué)指標(biāo)中雌性群體均值均大于雄性群體;3齡大麻哈魚除體重和凈體重均值為雄性大于雌性外，其余指標(biāo)均為雌性大于雄性。整體上，同一生長階段的大麻哈魚雌性群體個體較雄性群體稍大。2齡和3齡大麻哈魚性腺發(fā)育狀況一般，性成熟系數(shù)均較低。

2.2 大麻哈魚生殖相關(guān)的內(nèi)分泌激素水平

2.2.1 內(nèi)分泌激素水平 從表2看出，2齡、3齡雌性大麻哈魚血清中生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素值均高于雄性，且同性別中3齡大麻哈魚血清中生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素值亦均高于2齡。血清生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素含量最高的均為促卵泡素(FSH)，含量最低的均為睪酮(T)。

表1 大麻哈魚的基本生物學(xué)特征

表2 大麻哈魚血清生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素含量

2.2.2 內(nèi)分泌生殖激素間差異性及相關(guān)性 差異顯著性分析結(jié)果(表3，表4)表明，大麻哈魚雌、雄魚間的內(nèi)分泌生殖激素除睪酮(T)具有顯著差異外，其余的差異不顯著。2、3齡間內(nèi)分泌生殖激素除睪酮(T)具有顯著差異外，其余的均為差異極顯著。不同齡大麻哈魚各種性激素水平的相關(guān)性分析結(jié)果(表5)表明， 2齡大麻哈魚中各生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素之間相關(guān)性均極顯著。其中， LH與 FSH間相關(guān)性最強(qiáng)，達(dá)0.775； T與 GnRH間相關(guān)性最弱，僅0.445；說明2齡大麻哈魚個體之間生長差異不太明顯，故各種激素水平存在較強(qiáng)的相關(guān)性。3齡大麻哈魚除LH與各激素間相關(guān)性不顯著外，其余各激素間均具有極顯著相關(guān)性，且3齡大麻哈魚GnRH與FSH、T與E2間的相關(guān)性高于2齡，其他各激素之間的相關(guān)性均低于2齡。說明，隨著大麻哈魚年齡生長，群體中出現(xiàn)生長差異，個體間的差距變得逐漸明顯，導(dǎo)致其生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素之間的相關(guān)性出現(xiàn)較大變化。

表3 大麻哈魚不同性別間血清生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素的差異顯著性

表4 不同齡組間血清生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素差異顯著性

表5 大麻哈魚血清生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素間的相關(guān)系數(shù)

2.3 大麻哈魚的性腺組織解剖結(jié)構(gòu)

解剖觀察結(jié)果(圖1)顯示，2齡和3齡大麻哈魚卵巢呈淡黃色或粉白色，呈扁平狀，卵巢前端膨大、后端逐漸收縮變窄，由輸卵管連接至肛門，肉眼可見排列緊密的卵粒且卵粒不分離(圖1A,圖1D)。2齡大麻哈魚卵巢組織中主要由第Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ時相卵母細(xì)胞構(gòu)成(圖1B)，其中，第Ⅰ時相卵母細(xì)胞位于卵巢膜邊緣處，形狀不規(guī)則，呈三角形、長橢圓形等，卵徑較小，長徑(191.09±23.38) μm，短徑(114.52±11.66) μm，其在卵巢組織中所占比例為30.77%；第Ⅱ時相卵母細(xì)胞數(shù)量最多，占總細(xì)胞數(shù)的46.16%，呈長橢圓形，其中長徑(397.74±73.93) μm、短徑(304.69±66.06) μm；第Ⅲ時相卵母細(xì)胞數(shù)量最少，占23.08%，細(xì)胞呈圓形或卵圓形，其卵徑為(514.49±97.94) μm、核徑(190.38±17.62) μm (圖1C)。3齡大麻哈魚卵巢內(nèi)主要為第Ⅲ時相卵母細(xì)胞，約占細(xì)胞總量90%以上，及少量的第Ⅰ時相卵母細(xì)胞，所占比例低于10% (圖1E)；其中第Ⅲ時相卵母細(xì)胞多呈規(guī)則的圓形，卵徑為(709.36±153.46) μm、核徑(2 373.61±28.64) μm (圖1F)。

2齡和3齡大麻哈魚精巢呈長圓柱狀、較細(xì)，外觀淡紅色，能夠憑肉眼直接與卵巢區(qū)分開(圖1G,圖1J)。2齡大麻哈魚精巢組織學(xué)觀察結(jié)果顯示，精巢內(nèi)精母細(xì)胞處于精原細(xì)胞期，精原細(xì)胞為圓形、染色較深(圖1H, 1I)。而3齡大麻哈魚精巢內(nèi)的精母細(xì)胞，主要由少量精原細(xì)胞期及大量的初級精母細(xì)胞組成，期中精原細(xì)胞主要位于精小葉的邊緣處(圖1K)，而初級精母細(xì)胞則聚集在精小葉內(nèi)(圖1L)。

3 結(jié)論與討論

魚類的繁殖策略是其在長期進(jìn)化過程中與棲息環(huán)境條件逐步相適應(yīng)的結(jié)果，諸多研究表明，垂體激素、性類固醇激素、各類生長因子等均是影響魚類性腺發(fā)育的重要因素[2-5]。目前，有關(guān)魚類不同生長時期性類固醇激素水平與性腺發(fā)育之間關(guān)系的研究報道較多，如馬蘇大麻哈魚(Oncorhynchusmasou)[17]、泰山螭霖魚(Varicorhinusmacrolepis)[18]、達(dá)氏鰉(Husodauricus)[19]、大鱗鲃(Luciobarbuscapito)[20]和虹鱒(Oncorhynchusmykiss[21]等，以上研究表明，魚體在不斷生長過程中其性類固醇激素分泌水平與性腺發(fā)育狀況相協(xié)調(diào)，或呈一定的季節(jié)變化、或呈年度變化。研究結(jié)果表明，2齡、3齡血清生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素中含量最高的均為促卵泡素，含量最低的均為睪酮，各生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素之間存在不同程度的相關(guān)性，而3齡大麻哈魚促性腺激素釋放激素與促卵泡素、睪酮和雌二醇之間的相關(guān)性高于2齡，推斷大麻哈魚在不斷生長發(fā)育的同時，促性腺激素釋放激素通過正向調(diào)節(jié)垂體激素生成，進(jìn)一步促進(jìn)性類固醇激素的釋放，以此推動性腺中卵母細(xì)胞或精母細(xì)胞的生長發(fā)育。3齡大麻哈魚血清中生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素含量較2齡有明顯的提升，且性腺重量也相應(yīng)增加，說明在大麻哈魚性成熟之前，隨著年齡增加，魚體內(nèi)部生殖相關(guān)內(nèi)分泌激素的分泌量不斷提高，與達(dá)氏鰉[19]、大鱗鲃[20]等的研究結(jié)果一致。

性腺發(fā)育是魚類繁殖的基礎(chǔ)，通過了解性腺組織結(jié)構(gòu)可更好地掌握魚類的繁殖習(xí)性。魚類卵巢中卵母細(xì)胞的發(fā)育方式分為非同步型、部分同步型及完全同步型[22]。研究結(jié)果顯示，2齡大麻哈魚卵巢內(nèi)含有3個時相的卵母細(xì)胞，而3齡卵巢內(nèi)90%以上為第Ⅲ時相且缺乏第Ⅱ時相卵母細(xì)胞，說明大麻哈魚在生長過程中卵巢內(nèi)卵母細(xì)胞逐步發(fā)育為完全同步型，與野生環(huán)境下大麻哈魚一次性產(chǎn)卵的特性相吻合。根據(jù)硬骨魚類精巢內(nèi)精細(xì)胞的發(fā)育和分布特點，精巢結(jié)構(gòu)可分為小葉型和小管型[23]，其中大部分魚類精巢結(jié)構(gòu)屬于小葉型，如烏蘇里擬鲿(Pseudobagrusussuriensis)[24]、烏蘇里白鮭(Siberiangudgeon)[25]、翹嘴鲌(Culteralburnus)[26]等。本研究中2齡大麻哈魚精巢組織內(nèi)精母細(xì)胞處于精原細(xì)胞期，而3齡大麻哈魚精巢內(nèi)主要由少量精原細(xì)胞期及大量的初級精母細(xì)胞組成且初級精母細(xì)胞聚集在精小葉內(nèi)，說明2齡、3齡大麻哈魚精巢組織內(nèi)生殖細(xì)胞處于精原細(xì)胞向精母細(xì)胞轉(zhuǎn)化這一早期發(fā)育階段。黑龍江水系大麻哈魚溯河洄游繁殖群體主要為4～6齡、產(chǎn)卵期為9-11月[11, 27]。目前，人工養(yǎng)殖大麻哈魚在養(yǎng)殖過程中未出現(xiàn)性成熟個體的相關(guān)報道。研究結(jié)果顯示，隨著年齡的增長，性腺重量雖然在不斷增加，但性成熟系數(shù)卻減小，說明大麻哈魚在2齡、3齡生長階段，性腺生長速度低于魚體生長速度，在這一生長時期更側(cè)重于個體的生長，而3齡大麻哈魚卵巢在10月份時，其內(nèi)卵母細(xì)胞90%以上處于第Ⅲ時相，推測其已做好發(fā)育成熟的前期準(zhǔn)備，只待魚體生長至一定程度且季節(jié)、溫度、光照等外界條件適宜，性腺可迅速發(fā)育至成熟繁育狀態(tài)。