簡 燕，李小波，王 博，趙 靜，索海翠，黃安平，胡柏耿，曹春梅，張勇飛,*

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境生態(tài)研究所，湖南 長沙 410125；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點實驗室，廣東 廣州 510640；4.武漢基諾賽克科技有限公司，湖北 武漢 430070；5.北京諾禾致源科技有限公司，天津 301700；6.國家馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，山東 樂陵 253600；7.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

1991年國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（International Union for the Protection of New Varieties of Plants，UPOV）提出作物品種實質(zhì)派生現(xiàn)象的認(rèn)定標(biāo)準(zhǔn)、鑒定技術(shù)和該類品種附加的責(zé)任和義務(wù)。這些標(biāo)準(zhǔn)、責(zé)任、義務(wù)保護(hù)了育種者的權(quán)益，成為國際間農(nóng)業(yè)品種資源交流的重要考量因素[1]。目前，國際上普遍采用簡單序列重復(fù)（Simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）標(biāo)記作為鑒定品種實質(zhì)派生現(xiàn)象的主要標(biāo)記，但SSR標(biāo)記存在著標(biāo)記數(shù)量有限、對變異反應(yīng)敏感等問題，同時SNP標(biāo)記存在著檢測成本高的問題。

2019 年4 月底至5 月初，美國百事公司起訴4家印度小農(nóng)場主侵權(quán)使用百事公司的馬鈴薯品種，要求各農(nóng)場主支付侵權(quán)罰金[2,3]，給了國人一個很重要的提醒。中國馬鈴薯產(chǎn)品生產(chǎn)中是否也存在此類馬鈴薯品種侵權(quán)或者實質(zhì)派生現(xiàn)象？如何快速準(zhǔn)確鑒定馬鈴薯實質(zhì)派生品種？

通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)，通過群體遺傳等位基因分子系統(tǒng)進(jìn)化的方法可以比較個體間兩個基因組序列的相似性，這一方法已在相關(guān)研究中得到證實，并形成了計算進(jìn)化距離方法、核酸序列相似度和距離法、特征分值（Identity score，IS）計算辦法等[4-8]，這些都可用于作物品種間的相似度和實質(zhì)派生現(xiàn)象檢測[6-10]。本研究將利用基因組測序手段，將結(jié)合特征分值及馬鈴薯系統(tǒng)進(jìn)化樹枝長兩種分析方法，探索馬鈴薯實質(zhì)性派生品種鑒定的方法。

1 材料與方法

1.1 DNA提取和文庫構(gòu)建、測序和質(zhì)控

本研究使用的樣品由國家馬鈴薯工程技術(shù)研究中心及內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究中心提供（表1）。馬鈴薯薯塊常溫催芽，芽長5 cm左右時，取適量馬鈴薯塊莖芽頭組織，用酚氯仿異戊醇抽提法提取DNA。使用NanoDrop 2000 微量分光光度計檢測DNA純度，以滿足建庫測序要求。

分別構(gòu)建350 bp、2 K、5 K 文庫，進(jìn)行Illumina PE150 測序、基因組簡單組裝及變異檢測。將1.5 μg 的DNA 用Covaris 破碎機隨機打斷成長度為350 bp 的片段， 采用TruSeq Library Construction Kit 建庫，DNA 片段經(jīng)末端修復(fù)、加ployA 尾、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成文庫制備，文庫制備后使用Illumina HiSeq 進(jìn)行PE150 測序。檢測合格的DNA 樣品通過Covaris 超聲波破碎儀隨機打斷成片段，經(jīng)末端修復(fù)、加ployA、加羅氏環(huán)化接頭、環(huán)化、二次打斷、末端修復(fù)、加ployA、加測序接頭、純化、PCR 擴增等步驟完成整個大片段文庫（2 K、5 K、10 K）制備，構(gòu)建的文庫通過Illumina Hiseq PE150測序，得基因組原始數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過Cutadpat和Trimmimatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，獲得高質(zhì)量Clean data。

1.2 變異檢測

用BWA 軟件將Clean data 比對到參考基因組上，進(jìn)行變異檢測；再通過Samtools、Picard 軟件轉(zhuǎn)換格式，最后使用GATK 的HaplotypeCaller 模塊進(jìn)行變異檢測，獲得單核苷酸多態(tài)性（SNP）變異位點。

1.3 進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用鄰接法（Neighbor-joining methods）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。兩個體i 和j 之間的p-距離通過如下公式計算[9]：

表1 供試馬鈴薯樣品基本情況Table 1 Basic information of potato samples

式中，L 為高質(zhì)量SNPs 區(qū)域長度，在位置1的等位基因為A/C，那么個體i 和j 之間的d 有下列4種情形：

1.4 特性分值（IS）分析

特性分值（IS），是一種計算不同樣品之間序列一致性程度的分析方法，可用于輔助佐證群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。根據(jù)群體基因型文件進(jìn)行打分，將基因型文件轉(zhuǎn)化成由0、0.5 和1 三種遺傳距離參數(shù)值組成的Dsi 矩陣（純合且與參考基因組相同者Dsi 為0，純合且不同于參考基因組的Dsi 為1，雜合的Dsi 均為0.5），然后沿染色體按照每個窗口20 Kb 來 計算 每 個窗 口的IS 值[7-11]。IS 值越 大說 明兩個個體間差異越小。

為了保證研究材料的IS 比較的合理性，選擇馬鈴薯二倍體基因組作為統(tǒng)一的參考基因組，比較的每個材料的SNP 位點相對于參考基因組都是一樣的。

式中，Si 是在位點i 與參考基因組相似的位點數(shù)，n 是20 Kb 的窗口中的SNP 總數(shù)，n'是在20 Kb的窗口中缺失的位點數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

用鄰接法構(gòu)建25 個品種系統(tǒng)進(jìn)化樹，可以反映出品種間的親緣關(guān)系（圖1）。以‘Favorita’、‘夏坡蒂’和‘希森9 號’為代表的3 個馬鈴薯品種展現(xiàn)了其親緣關(guān)系較近的聚類群。

其中，‘YM8’和‘YM13’均為‘夏坡蒂’品種，但來源于不同地區(qū)，‘YM8’來自國家馬鈴薯工程技術(shù)研究中心，‘YM13’來自內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，兩者位于同一個聚類中。這說明：第一，進(jìn)化樹枝長可以作為判定親緣關(guān)系的依據(jù)；第二，同一品種不同地區(qū)的馬鈴薯由于自然生長環(huán)境不同，會導(dǎo)致在個體之中出現(xiàn)不同的自然變異，表現(xiàn)出SNP不完全一致的現(xiàn)象。

‘YM4’和‘YM5’兩個樣品為同一遺傳背景起源的姊妹系，但在進(jìn)化樹中被歸為不同的聚類。說明，馬鈴薯品種是雜合體，且同一個遺傳背景，因配子的不同組合，可帶來較大的遺傳結(jié)構(gòu)組成差異。

‘YM9’（希森3 號），‘YM23’（荷蘭15 號）和‘YM10’（荷蘭薯費烏瑞它）這3 個品種被聚在一起，而且枝長很短。其實，這剛好反映了這3 個品種的費烏瑞它家族成員的遺傳背景（表1），而且無論是‘希森3號’還是‘荷蘭15號’都與‘費烏瑞它’具有實質(zhì)類似的特點。聯(lián)想到‘費烏瑞它’基本不具備晚疫病抗性和‘希森3 號’是華南和西南地區(qū)近年來豐產(chǎn)性很好的稻后冬閑田種植馬鈴薯的主栽品種，這自然也在提醒冬馬鈴薯種植者要重視他們種植的馬鈴薯的晚疫病防控問題。

為驗證極短枝長是否可判斷超近親緣關(guān)系，從25 個品種中選取14 個品種，選擇3 個不同來源的馬鈴薯新品種‘合作88’作為內(nèi)控，再選取2 個外型接近的馬鈴薯品種‘黑金剛’和‘華頌66’，共計20 個馬鈴薯品種樣品作為研究系統(tǒng)進(jìn)化分析的鄰接樹構(gòu)建材料。

由圖2 可見，3 個不同來源的內(nèi)控馬鈴薯品種‘合作88’被聚在非常近的聚類中，其枝長分別為0.063 0、0.062 3、0.061 2。與此同時，‘YM10’和‘YM23’分別為‘荷蘭薯費烏瑞它’和‘荷蘭15號’，親緣關(guān)系來自荷蘭的品種‘Favorita’，因引種到不同地區(qū)，被賦予不同的中文名字（表1），但通過聚類驗證，被聚在相同的聚類群中，其枝長較短為0.057 8 和0.057 7。由此可以表明，進(jìn)化樹的枝長可以作為判斷馬鈴薯品種的親緣關(guān)系。對此，‘HJG’（黑金剛）與‘HS66’（華頌66）2 個外型接近的馬鈴薯品種在同一聚類群中，其枝長分別為0.057 2 和0.057 4，表現(xiàn)為同一品種，應(yīng)該是互為實質(zhì)派生品種。

2.2 馬鈴薯特征分值（IS）分析和分型結(jié)果

表2 為20 個馬鈴薯驗證品種的IS 結(jié)果，由此可知，3 個不同來源的內(nèi)控馬鈴薯品種‘合作88’都有較高的IS 值，分別是0.921 5，0.925 7，0.924 6；同一荷蘭‘Favorita’品種的‘YM10’和‘YM23’，其IS 值達(dá)到0.928 0，高于‘合作88’所代表的閾值0.925 7。與此同時，‘HJG’與‘HS66’兩個外型接近的馬鈴薯品種間IS 值最高，為0.929 6。此結(jié)果也支持‘HJG’與‘HS66’是互為派生品種的判斷。

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3 討 論

馬鈴薯品種屬于營養(yǎng)繁殖的植株塊莖材料，在選育過程中存在姊妹系的現(xiàn)象（表1）。這是因為馬鈴薯親本選育時對不同相似度缺乏足夠的研究，不同于國際頂級育種公司在玉米育種中事先制定標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格控制育種親本時的相似度和姊妹系的出現(xiàn)。與此同時，本研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯品種間確實存在實質(zhì)等同現(xiàn)象。育種家往往根據(jù)親本之間有一定差異的原則來進(jìn)行親本選擇，而派生品種越來越多，馬鈴薯會失去較大的遺傳多樣性，很難培育出突破性品種，育種難有提高，長此以往將對國家糧食安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅[10-12]。因此，及時制止這一現(xiàn)象，對保護(hù)馬鈴薯核心種質(zhì)資源，改良馬鈴薯品種，提高產(chǎn)量，保護(hù)育種者權(quán)益，提高育種者投入和研發(fā)的動力至關(guān)重要。

目前，馬鈴薯品種間相似度判斷仍主要依賴于SSR 標(biāo)記，但這種方法存在明顯弊端[13]，僅能捕捉不及三分之一的差異，受基因組中轉(zhuǎn)座子因子的影響也可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不能真實反映基因組之間的關(guān)系。隨著高通量測序技術(shù)的運用，通過SNP 變異位點的檢測，對基因數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，能對基因組相似度進(jìn)行定量分析[14,15]。

本研究中，內(nèi)控的馬鈴薯品種‘合作88’的三個不同來源的樣品通過系統(tǒng)進(jìn)化分析，枝長極短；通過特征分值（IS）分析，具有較高IS 值，被聚在非常近的聚類中。‘YM10’和‘YM23’為同一品種生長不同環(huán)境下，通過系統(tǒng)進(jìn)化與IS 分析同樣發(fā)現(xiàn)其枝長極短，IS 值較高。這說明了進(jìn)化樹的枝長與IS 分析，可以作為判斷來源不同的馬鈴薯薯塊樣品是否來自同一品種，或者是否實質(zhì)派生品種的依據(jù)?！诮饎偂汀A頌66’兩者之間的枝長比‘合作88’三個不同種植地點所取樣品間的枝長要小，特征分值達(dá)到了0.929 6，高于同一品種不同來源薯塊間的特征分值結(jié)果，可以確定是一對實質(zhì)派生品種的候選者。但是具體用什么特征分值的標(biāo)準(zhǔn)作為檢測實質(zhì)派生品種的閾值，請管理部門主持制定標(biāo)準(zhǔn)的討論，并且盡快提出檢測實質(zhì)派生的基于特征分值或者基于系統(tǒng)進(jìn)化分析的建議標(biāo)準(zhǔn)，以解決馬鈴薯生產(chǎn)中存在的實質(zhì)派生問題和品種同質(zhì)化過于嚴(yán)重的問題。

另外，從以上結(jié)果也可以得出，即便是同一個品種，在不同種植條件和種植代數(shù)下，會存在和積累不同的自然突變，因此，馬鈴薯品種的同一個品種不同薯塊的基因組不會是完全一致的。

綜上所述，系統(tǒng)進(jìn)化樹的枝長與特征分值可以作為一個快速判斷品種是否存在實質(zhì)派生現(xiàn)象的依據(jù)。建議對所有參加馬鈴薯品種審定的品種，在進(jìn)行DUS 測試的同時進(jìn)行實質(zhì)派生品種鑒定，并保存DNA樣本。