楊亞茹 茆少星 閆淑珍

摘要 為了檢驗內生菌熒光假單胞菌DLJ1和蠟狀芽胞桿菌SZ5的促生與提高植株對南方根結線蟲的防治效果，確定合適的菌劑接種方式，并分析其機制，本文以殺線劑阿維菌素為對照，比較了不同接菌方式下DLJ1 和SZ5對辣椒植株在南方根結線蟲脅迫下的抗性以及對產量品質的影響。結果證實DLJ1在種子萌發(fā)期的一次接菌與萌發(fā)期與田間的5次接菌處理均可使根系根結數(shù)減少70%以上，使植株對南方根結線蟲的抗性升至高抗級別，辣椒產量提高超過150%;DLJ1一次接菌處理組的果型最大、Vc與可溶性蛋白含量最高。SZ5萌發(fā)期一次處理根結數(shù)降低40%，植株對南方根結線蟲表現(xiàn)為中抗，產量提高60%以上;SZ5多次接菌處理根結數(shù)只能降低27%，產量僅提高6%左右。阿維菌素處理的效果介于DLJ1和SZ5之間，可降低植株根結數(shù)45%，提高產量49%左右。分析其機理發(fā)現(xiàn)，兩菌劑處理均可通過提高植株的POD酶活性和總酚含量，降低O-2產生速率和MDA積累，提高光合色素含量等來促進植物生長，通過提高幾丁質酶活性來提高植株對線蟲的抗性?？傊?，只需要在辣椒種子萌發(fā)期進行一次DLJ1接菌處理，即可使植株獲得穩(wěn)定而顯著的促生和防治南方根結線蟲雙重效果，提示DLJ1菌在農業(yè)生產上的應用前景廣闊。

關鍵詞 植物內生菌; 辣椒; 南方根結線蟲; 抗性; 產量; 品質

中圖分類號： S 476

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019513

Abstract Two endophytes， DLJ1 （Pseudomonas fluorescens biovar I） and SZ5 （Bacillus cereus）， and a nematicide abamectin were used to compare their effects on the improvement of plant growth and plant resistance to Meloidogyne incognita， to determine the appropriate mode of inoculation， and to analyze its mechanism. The results showed that inoculation with DLJ1 once at germination stage or once at germination stage and 5 times in the field could decrease the number of root nodules by over 70%， improve the resistance of pepper plants to M.incognita to a high level， and increase the yield by over 150%. The fruit size was the biggest， and the contents of Vc and soluble proteins were the highest in the inoculation-with-DLJ1-once group. Inoculation with SZ5 once at germination stage reduced the number of root nodules only by 40%， improved the plant resistance to a medium level， and increased the yield by over 60%. Multiple inoculation with SZ5 decreased the number of root nodules only by 27% and increased the yield by 6%. The effect of abamectin treatment was between that of DLJ1 treatment and SZ5 treatment， which could reduce root nodules by about 45% and increase yield by about 49%. The results also showed that the growth-promoting effect of the two endophytes was possibly attributed to the increase of the POD activity and the total phenol content， the decrease of the O-2 production and MDA accumulation， and the enhancement of photosynthetic pigments contents in plants; the improved resistance of plants to nematodes was possibly attributed to the increase of chitinase activity in plants. In a word， inoculation of pepper plants with DLJ1 only once at the germination stage could achieve stable and significant effects of growth promoting and control of M.incognita. This suggests that DLJ1 has a broad application prospect in agricultural production.

Key words endophyte; Capsicum annuum; Meloidogyne incognita; resistance; yield; quality

一年生茄科Solanaceae植物辣椒Capsicum annuum Linn.最常見、危害最大的土傳病害是南方根結線蟲Meloidogyne incognita Chitwood病[1]。雖然目前生產上有多種防治手段，但由于存在農業(yè)防治方法效率低、物理防治費用高、化學防治環(huán)境污染以及生物防治專一性強、穩(wěn)定性差等原因，對該病害的防治效果一直不理想。

篩選潛在生防菌劑最常用的方法是從根際微生物中尋找對病原物有直接殺傷作用的菌株。但由于根際微生物受土壤環(huán)境影響巨大，作用不穩(wěn)定，導致現(xiàn)在多數(shù)生防菌劑的應用受到一定限制。而內生菌由于定植于植物內部，作用穩(wěn)定、環(huán)境友好，而且一系列研究還顯示內生菌定殖后可以通過誘導植物防御反應來提高植株對逆境脅迫的抗性[2-3]。因此，篩選和利用合適的內生菌作為生防和促生菌劑是當前國際生物防治學和逆境生物學的熱點內容[2-5]。

我們前期的工作顯示，兩株能夠在辣椒體內定殖的內生菌熒光假單胞菌（生物型Ⅰ）Pseudomonas fluorescens （biovar Ⅰ）DLJ1[6]和蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus SZ5[7]均可以產生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate， 簡稱ACC）脫氨酶。雖然DLJ1在體外沒有直接抑殺南方根結線蟲的能力，但已有初步試驗證實它比具有直接抑殺活性的SZ5更能促進辣椒生長，降低植株染病率，提高辣椒產量[8];并且萌發(fā)期的一次接菌處理，其生防效果可以維持終身。上述結果雖然提示萌發(fā)期一次接種DLJ1就可以在生產上發(fā)揮顯著作用，但還有如下問題尚未確定：DLJ1和SZ5的生防效果是否穩(wěn)定，如果在萌發(fā)期和移栽期同時接菌是否可以更好地發(fā)揮作用，與最常用的殺線劑阿維菌素相比，這兩株內生菌的生防效果如何，以及兩株菌的生防機制是什么。

鑒于此，本文繼續(xù)以DLJ1和SZ5兩株菌為試驗材料，在萌發(fā)期、移栽期及田間，分別通過浸種、蘸根和土壤灌根等方式接種菌劑，并以阿維菌素為對照，確認DLJ1和SZ5提高辣椒植株對南方根結線蟲的生防作用;探討在萌發(fā)期、移栽期和田間的多次疊加接菌處理是否可以更好地抑制發(fā)病、提高辣椒產量和品質;并與阿維菌素的效果相比，分析植物內生菌DLJ1在農業(yè)生防上的可能應用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

辣椒C.annuum 種子，品種為‘韓育特大牛角椒，購自江蘇省農業(yè)科學院種子站。熒光假單胞菌（生物型Ⅰ）P.fluorescens （biovar Ⅰ）DLJ1（分離自辣椒果實）[6]和蠟狀芽胞桿菌B.cereus SZ5（分離自成熟柿子）[7]由南京師范大學微生物工程研究中心篩選獲得。南方根結線蟲M.incognita MIJS3，由南京農業(yè)大學植保學院李紅梅老師饋贈。泥炭育苗塊（加拿大 Jiffy公司，直徑3 cm）與全營養(yǎng)型速溶肥（花多多1號，美國 Scotts公司）均直接從市場購得。

1.2 處理方法

試驗于2017年在南京師范大學植物園內進行。

1.2.1 菌懸液制備

參照劉維紅等的方法[9]，將兩菌株活化、培養(yǎng)、收集、洗滌、沉淀后，再用無菌水重懸沉淀至OD600值0.5±0.02，得到濃度相當于108 cfu/mL的菌懸液。

1.2.2 種子萌發(fā)與接菌、接線蟲等處理

種子萌發(fā)與接菌：在3月13日按常規(guī)方法進行種子洗滌與30℃浸種12 h后，再置于事先用5 mL無菌水或菌懸液浸潤的濾紙培養(yǎng)皿上、30℃ 16 h/20℃ 8 h黑暗中萌發(fā)。待種子萌發(fā)8 d后，在每組中選取長勢一致的辣椒幼苗移栽到泥炭育苗塊上，定期澆水，每周澆灌一次0.1%的全營養(yǎng)速溶肥，待長到4～6葉期將幼苗移栽到南京師范大學植物園中。

移栽與接菌：5月30日移栽時，根據(jù)萌發(fā)期的各種處理，取各處理組的一半植株進行相應的傷根浸菌5 min后，移栽到田間;移栽后，于6月19日、7月8日、7月29日和8月18日在移栽期接菌的各辣椒苗根部周圍2～3 cm的土壤中均勻挖2個深3～5 cm的小孔，每孔灌入2.5 mL濃度為108 cfu/mL的相應菌懸液，共接種4次。

線蟲獲取：參照孟莎莎等的方法[10]分離番茄根部根結線蟲卵塊，26℃培養(yǎng)，孵化得2齡幼蟲。參照彭雙等的方法[11]分別在植物移栽后的7月2日和7月6日，每株每次接種2齡幼蟲250條。

阿維菌素處理：分別在7月15日和7月29日，對部分未接菌的植株以1.8%阿維菌素乳油稀釋1 000倍，每株灌根5 mL。

1.3 生理指標測定

在7月15日施加阿維菌素前和8月9日取正4位的葉片分別進行兩次植物生理指標測定。

各光合色素含量測定和計算參照陳福明等的方法[12]。超氧陰離子（O-2）的測定參照劉彤彤等的方法[13]。POD活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[14]。SOD活性的測定采用氮藍四唑光化學還原法[15]，過氧化氫酶（CAT）活性的測定用Cakmak等的方法[16]。苯丙氨酸裂解酶活性測定按照劉太國等的方法[17]。多酚氧化酶活性測定參照朱宏波等的方法[18]?？傸S酮含量測定參照王靜的方法[19]?？偡雍繙y定參照滕冰等的方法[20]。β-1，3-葡聚糖酶液的提取參照史益敏[21]的方法，活性測定參照余永延等[22]的方法。幾丁質酶測定參考楊海霞等[23]的方法，膠體幾丁質的制備參考Nitoda等[24]的方法。脂氧合酶測定方法運用標準分光光度法[25]。

1.4 果實相關指標測定

分別在7月27日、8月15日和9月6日，每個處理組隨機取10株植株，采摘果實并計算產量。并在8月15日對采摘的果實進行單果直徑、果長以及單果重等的測量（n=10），并用紫外分光光度法測定果實Vc含量（以每100 g鮮果中含有Vc 的mg數(shù)計）[26]，用考馬斯亮藍法測定果實可溶性蛋白含量（以每g鮮果中含有可溶性蛋白的mg數(shù)計）[27]、用蒽酮比色法測定果實可溶性糖含量（以每100 g干果中含有可溶性糖的g數(shù)計）[28]。

1.5 病情指數(shù)與抗性指標測定

在試驗末期（9月9日），每組隨機拔取5株植株，將根系用流水沖洗凈，調查根結比例并計算病情指數(shù)，確定抗性級別。

根結等級采用Garabedian等的分級標準[29]（表1）和白春明等的抗性指標[30]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗結果以平均值表示，試驗數(shù)據(jù)的處理和相關分析用Microsoft Excel 2010、GraphPad Prism 5和SPSS 18.0軟件完成。圖表中不同小寫字母表示同一時期不同處理間有顯著性差異（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 DLJ1和SZ5菌劑處理對南方根結線蟲脅迫下辣椒葉片光合色素含量的影響

在南方根結線蟲（以下簡稱線蟲）處理初期（表2），只有萌發(fā)期接菌一次的DLJ1-1組的各光合色素含量顯著高于對照，其余組均與對照相當;但如果在移栽期以及田間繼續(xù)補接種DLJ1，會導致該組（DLJ1-3）的光合色素含量顯著下降，葉綠素a的含量低于對照;SZ5-1和SZ5-3組的各光合色素含量與對照相當。隨著植株生長和線蟲脅迫時間延長，各組光合色素含量均呈下降趨勢，但各處理組的光合色素含量均顯著高于對照。其中以DLJ1-1組的色素含量最高，DLJ1-6組次之，阿維菌素組的光合色素含量介于對照組和SZ5-1組之間。由此可見，菌劑處理，尤其是DLJ1的萌發(fā)期一次處理，就可以減少南方根結線蟲脅迫下辣椒植株光合色素含量的降低幅度，提示菌劑處理提高了植株對線蟲的抗性;DLJ1的處理效果最強，阿維菌素次之， SZ5最弱。

1） 1：挑戰(zhàn)接種線蟲13 d時的測定結果，此時尚未有阿維菌素對照組;2：挑戰(zhàn)接種線蟲38 d時的測定結果。SZ5-1與DLJ1-1：萌發(fā)期接菌1次;SZ5-3與DLJ1-3：萌發(fā)期與移栽期共接菌3次;SZ5-6與DLJ1-6：萌發(fā)期與移栽期共接菌6次。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示同一時期不同處理間有顯著性差異（P<0.05）。下同。

1： Results are from plants after challenge inoculation with nematode for 13 days， without an abamectin control group at this time. 2： Results are from plants after challenge inoculation with nematode for 38 days. SZ5-1 and DLJ1-1： Inoculated once at germination stage; SZ5-3 and DLJ1-3： Inoculated three times at germination stage and transplanting stage; SZ5-6 and DLJ1-6： Inoculated six times at germination stage and transplanting stage. Different small letters indicate significant difference between different treatments during the same period （P<005）. The same applies below.

2.2 DLJ1和SZ5菌劑處理對南方根結線蟲脅迫下辣椒植株代謝的影響

2.2.1 對氧化脅迫和抗氧化能力的影響

菌劑處理不僅影響植株光合色素含量，還影響植物體其他代謝過程。表3展示了短期（13 d）和長期（38 d）線蟲脅迫對各處理組葉片氧化傷害程度和抗氧化能力的影響。線蟲脅迫初期，除DLJ1-3組外，菌劑處理并沒有顯著降低O-2產生速率和MDA累積，也沒有顯著提高以SOD、POD和CAT為代表的抗氧化酶活性和以總黃酮和總酚為代表的抗氧化物質含量;僅在DLJ1-3組出現(xiàn)了抗氧化酶活性的小幅提高與植株O-2產生速率和MDA累積量的下降。

隨著植株生長和線蟲脅迫時間的延長，對照組的總黃酮、總酚含量和SOD活性下降，POD和CAT活性升高，O-2產生速率增加、MDA積累加劇;DLJ1-1和SZ5-1組的總酚含量仍維持相對較高水平，POD和CAT活性較對照有大幅提高，導致這兩組的O-2產生速率和MDA含量也較對照有大幅降低。這提示菌劑處理可以通過提高以POD和CAT為代表的抗氧化酶系統(tǒng)活性，提高植株對線蟲的抗性、降低氧化傷害。雖然DLJ1-6和SZ5-6組的總黃酮和總酚含量、POD和CAT活性均顯著高于對照，但是這兩組的O-2產生速率和MDA累積量仍與對照相當。這可能是因為多次的灌根刺激也在一定程度上對植物造成一定的脅迫效應。

因此，從氧化傷害與抗氧化保護角度考慮，萌發(fā)期的一次接菌處理對植物抗性提高效應更為顯著。雖然阿維菌素處理組植株的POD、CAT活性高于對照，其O-2產生速率和MDA含量仍均與對照相當，其中原因還有待進一步探討。

2.2.2 對病程相關蛋白酶活性的影響

病原菌侵襲可以誘導植物產生β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質酶和脂氧合酶等為代表的病程相關蛋白（pathogenesis related protease，簡稱PR）[31-32]。表4展示了不同菌劑、不同處理方式對辣椒植株這3種酶活性的不同程度的影響。

在線蟲脅迫早期，與對照相比，SZ5-1和DLJ1-1組中這3種酶活性的變化幅度都相對不大;SZ5-3和DLJ1-3組的β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶活性均有大幅度提高。隨著植株生長和線蟲脅迫時間的延長，對照組的幾丁質酶活性下降，脂氧合酶活性升高;雖然各菌劑處理組的β-1，3-葡聚糖酶酶活性變化方向不同，脂氧合酶沒有顯著變化，但DLJ1-1、SZ5-6和DLJ1-6三組的幾丁質酶活性均顯著高于對照。植株的幾丁質酶活性提高意味著植株對線蟲體壁的降解力增強，植物的抗性增強。阿維菌素處理僅使植株的β-1，3-葡聚糖酶活性顯著低于對照，提示阿維菌素并不是通過提高植物的病程相關蛋白酶活性來提高植物的抗性[33]。

2.3 DLJ1和SZ5菌劑處理對南方根結線蟲脅迫下辣椒果實產量與品質的影響

種植辣椒的最終目的是獲得高產優(yōu)質的辣椒果實。表5展示了各處理組的果型、產量和品質的比較結果。從果型看，SZ5-1、SZ5-6組和阿維菌素組的果型相對較小;DLJ1-1和DLJ1-6組，尤其是DLJ1-1組的果實相對較大，單果重較對照高443%。而從產量角度分析，各處理均能提高辣椒產量，但DLJ1處理組效果最佳。DLJ1-6組和DLJ1-1組的產量分別比對照提高了173.38%和156.69%，DLJ1-6組的產量僅比DLJ1-1組高639%。SZ5-1組和SZ5-6組的產量提高幅度則相對較?。ㄔ斠姳?），阿維菌素組的產量介于CK與SZ5-1組之間。萌發(fā)期的一次接種DLJ1處理，其增產效果是2次阿維菌素處理的3倍以上;如果在移栽期和田間繼續(xù)進行5次補接菌處理，勞動力和生產成本大幅提高，但增產幅度卻不大。因此，在后期應用上，建議在萌發(fā)期接種DLJ1一次即可。

比較各組果實的Vc、可溶性蛋白和可溶性糖含量可見，雖然各組各物質含量變化幅度不同，但它們均不低于對照;DLJ1-1組果實的Vc和可溶性蛋白含量均顯著高于對照，DLJ1-6組的各物質含量并不顯著高于DLJ1-1組;阿維菌素組的可溶性蛋白和可溶性糖含量高于對照，但Vc含量低于對照。以上結果表明，DLJ1和SZ5內生菌在辣椒萌發(fā)期一次處理不僅能提高產量，還能提高品質，且比常用殺線劑阿維菌素的效果更好。

2.4 DLJ1和SZ5菌劑處理對南方根結線蟲脅迫下辣椒植株染病率的影響

植株根系發(fā)育程度以及根部卵塊數(shù)和根結數(shù)等是植株感染線蟲病的直接指標。在辣椒采摘結束后，挖取根系，測量根徑、計數(shù)整個根系的卵塊數(shù)和根結數(shù)，并按表1 中的病情指數(shù)和抗性分級標準對各組進行綜合評價，具體結果見表6。試驗使用的辣椒對南方根結線蟲有一定的抗性，兩菌劑處理進一步促進了辣椒根系生長，降低了卵塊數(shù)和根結數(shù)，提高了植株對線蟲的抗性。DLJ1處理導致根徑增粗幅度、卵塊數(shù)和根結數(shù)的降低幅度高于SZ5處理，植株對線蟲的抗性（高抗）也高于SZ5處理組（中抗）。與多次接菌的DLJ1-6組相比，萌發(fā)期接菌一次的DLJ1-1組除根徑略小外，其余指標兩者均相當。這再次確認，DLJ1和SZ5兩株內生菌，尤其是DLJ1，在萌發(fā)期的一次接菌處理就可以穩(wěn)定提高辣椒植株對南方根結線蟲的抗性。

阿維菌素組的卵塊數(shù)與DLJ1組相當，根結數(shù)和病情指數(shù)介于DLJ1處理組與SZ5處理組之間，植株亦表現(xiàn)為高抗。SZ5處理組的防治效果不及阿維菌素。雖然DLJ1處理組的卵塊數(shù)稍高于阿維菌素組，但根結數(shù)較阿維菌素組降低約50%，而且根系生長狀況較好。這再次表明，在提高辣椒對南方根結線蟲的抗性效果方面，DLJ1優(yōu)于阿維菌素。

3 討論

在將微生物應用于生防前，篩選合適菌株是第一步需要解決的問題。人們曾經認為生防菌的生防機制主要在于其對病原物的直接抑殺作用。因此，篩選生防菌多是先采用直接對峙法篩選出對病原物有直接殺傷作用的菌株，再根據(jù)其在植物體和田間應用的效果進行進一步的篩選。這一方法的優(yōu)點在于篩選目標明確、篩選速度快。淡紫擬青霉等生防菌株就是應用這一方法篩選得到的[34]。

隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)田間生態(tài)環(huán)境的波動影響了生防菌的生存和繁衍，也影響了生防菌的田間應用效果。而有一群對植物生長有益的內生菌，它們能在植物體內穩(wěn)定地生長、繁衍。它們或通過分泌激素促進植物生長，或通過提高礦質元素的可利用性給植物提供養(yǎng)分，或通過占據(jù)有益生態(tài)位、或抑殺病原菌等來提高植物的抗病能力，或通過誘導植物防御反應（induced systemic resistance，簡稱ISR）來提高植株對病害的抗性[3-5]。而具有ISR效應的微生物并不一定對病原菌具有直接抑殺效應。

大量研究發(fā)現(xiàn)，具有分泌ACC脫氨酶的微生物菌株多數(shù)具有促進植物生長的能力[35-36]。DLJ1和SZ5就是在篩選產ACC脫氨酶菌株中得到的兩株菌[6-8]。DLJ1分泌的ACC脫氨酶活性是SZ5的4倍，DLJ1的促生效果也顯著高于SZ5。此外，在挑戰(zhàn)接種南方根結線蟲后，萌發(fā)期接種DLJ1能更有效地提高植株對線蟲的抗性，更有效地提高辣椒產量和品質。

為何DLJ1，尤其是萌發(fā)期的一次接種DLJ1，就可以有效促進植物生長，提高植株抵御線蟲的能力呢？首先，接種菌劑后，菌劑進入植物體內部從而影響植物對脅迫的反應;伴隨著線蟲脅迫時間的延長，植物以POD活性、CAT活性和總酚含量為代表的抗氧化能力提高，以 O-2產生速率和MDA累積量為代表的氧化傷害程度降低;植物光合色素含量提高，植物光合效率提高，從而最終表現(xiàn)出植物抗性提高、生長受到促進。此外，伴隨著處理時間的延長，內生菌處理組，尤其是DLJ1處理組幾丁質酶活性提高。植物分泌相對高活性的幾丁質酶，可以有效降解線蟲體壁，抑制線蟲的生長和繁衍，提高植物對線蟲的抗性[31-32]。最終DLJ1處理組植株對線蟲表現(xiàn)為高抗，SZ5處理組植株表現(xiàn)為中抗。DLJ1較SZ5生防效應高的原因不僅可能與DLJ組植物更高的抗氧化能力、幾丁質酶活性和光合能力等相關，還可能與DLJ1產生高活性的ACC脫氨酶活性有關。這其中的深層次機制還有待進一步探討。

阿維菌素是目前市場上最常用的高效殺線劑。其殺線蟲機制在于通過直接抑制線蟲神經系統(tǒng)的發(fā)育來抑制線蟲生長、繁衍，屬于直接抑殺作用范疇[33]。與菌劑處理組比較，雖然阿維菌素處理組植物的光合色素含量和抗氧化能力也有一定程度提高，但該組所遭受的氧化傷害并沒有降低，幾丁質酶活性和根系直徑也沒有提高。具有直接抑殺作用的阿維菌素的生防效果弱于沒有直接抑殺作用的DLJ1，強于有直接抑殺作用的SZ5。這一結果不僅預示了DLJ1在田間的應用前景，同時也提示用單一的體外抑殺試驗篩選潛在生防菌可能會漏選潛在有益微生物。

綜上所述，本試驗不僅再次確認了DLJ1和SZ5在種子萌發(fā)期的一次接菌處理，就可以提高辣椒植株對線蟲的抗性，提高辣椒產量，DLJ1的效果優(yōu)于SZ5;同時還發(fā)現(xiàn)，菌劑，尤其是DLJ1菌劑處理還促進了辣椒果實增大、品質提高;如在移栽期及后期多次補接菌，增產效果并不顯著;兩次阿維菌素的田間處理，雖然也有顯著防病效果，但效果不及DLJ1。DLJ1的萌發(fā)期一次處理就有顯著而穩(wěn)定的促生和生防雙重效果，顯示其在農業(yè)生產上應用前景廣闊。

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（責任編輯：田 喆）