段云 郭培 鞏中軍

摘要 癭蚊科是雙翅目昆蟲中的重要類群。本研究對(duì)癭蚊科3種昆蟲—麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊的核糖體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆、測(cè)序及序列分析，并對(duì)ITS-1在麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群中的遺傳變異情況進(jìn)行分析。結(jié)果表明，從3種昆蟲中獲得的核糖體DNA序列包括：部分的18S rDNA（44 bp）、28S rDNA（37 bp），全部的ITS-1（487～535 bp），5.8S rDNA（121 bp）及ITS-2（336～352 bp）序列。3種昆蟲ITS序列的堿基差異百分比在17.21%～29.59%之間，共含有206個(gè)變異位點(diǎn)。ITS-1序列在麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群中比較保守，只有4個(gè)變異位點(diǎn)，單倍型多樣性為0.311 7～0.796 5，核苷酸多樣性為0.000 6～0.002 2。本研究為今后癭蚊科昆蟲的分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和遺傳進(jìn)化等相關(guān)研究提供了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 癭蚊科; 核糖體DNA; 序列分析; 分子鑒定

中圖分類號(hào)： Q 963

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019400

Abstract Cecidomyiidae is an important insect group in the order Diptera. The ribosomal DNAs from three gall midges， Sitodiplosis mosellana， Rhopalomyia longicauda and Aphidoletes aphidimyza， were studied by PCR amplification， cloning， sequencing and sequence analysis. The genetic variation of ITS-1 in four geographical populations of S.mosellana was analyzed. The results showed that the rDNA sequences of three insects included partial sequences of 18S rDNA （44 bp） and 28S rDNA （37 bp）， complete sequences of ITS-1 （487-535 bp）， 5.8 S rDNA （121 bp） and ITS-2 （336-352 bp） sequences. The difference among ITS sequences was between 17.21% and 2959%， including a total of 206 variant sites. There was little difference in the ITS-1 sequence among the four geographical populations of S.mosellana， with only 4 variant sites， a haplotype diversity of 0.311 7-0.796 5， and a nucleotide diversity of 0.000 6-0.002 2. This study provides a basis for the study of identification， phylogeny and genetic evolution of gall midges of the Cecidomyiidae family.

Key words Cecidomyiidae; ribosomal DNA; sequence analysis; molecular identification

癭蚊科Cecidomyiidae隸屬于雙翅目Diptera，是一類雄蟲觸角具環(huán)毛，翅上顯著縱脈不超過5條的蚊類昆蟲。由于該科許多種類昆蟲的幼蟲在植物上形成蟲癭，故通稱為癭蚊[1]。癭蚊科是具有重要經(jīng)濟(jì)意義的一個(gè)大科，在世界范圍內(nèi)廣泛分布[2]。目前，全球已知的癭蚊科昆蟲有6 590多種，其中包括多種為害農(nóng)作物、蔬菜、花卉、樹木和果樹的重要害蟲[3]，如麥紅吸漿蟲Sitodiplosis mosellana、黑森癭蚊Mayetiola destructor、菊花癭蚊Rhopalomyia longicauda、刺槐葉癭蚊Oblodiplosis robiniae和高粱癭蚊Contarinia sorghicola等，也包括若干捕食蚜蟲、螨類和介殼蟲等的天敵昆蟲，如食蚜癭蚊Aphidoletes aphidimyza和Feltiella acarisuga等[4-7]。

目前，癭蚊科昆蟲已成為研究昆蟲-寄主之間協(xié)同進(jìn)化的重要材料。傳統(tǒng)的癭蚊科昆蟲種類鑒定主要以形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)，對(duì)于相近種，特別是對(duì)于幼蟲和卵，利用形態(tài)學(xué)特征鑒定存在很大的局限性，而以DNA序列為基礎(chǔ)的分子鑒定，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。目前已開發(fā)的癭蚊科昆蟲DNA分子標(biāo)記還相對(duì)較少，且主要集中在線粒體基因的應(yīng)用上[5，8-10]，而關(guān)于核基因序列的相關(guān)研究卻很少[11]。

內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer， ITS）是高度重復(fù)的核糖體DNA（rDNA）中介于18S rDNA和28S rDNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，包括存在于18S rDNA和5.8S rDNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1（ITS-1）和存在于5.8S rDNA和28S rDNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2（ITS-2）兩個(gè)序列[12-13]。ITS受外界環(huán)境因素的影響較小，與編碼區(qū)域相比具有進(jìn)化速度慢的特點(diǎn)，在種內(nèi)具有高度的保守性，在不同種間及亞種間又表現(xiàn)出極大差異[14]。同時(shí)，ITS具有大量的拷貝，很容易進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]。因此，ITS作為一種重要的分子標(biāo)記和線粒體DNA信息的補(bǔ)充，在昆蟲學(xué)的研究中越來越受到重視，并且已被廣泛用于昆蟲分類學(xué)、昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究中，在物種鑒定、（種內(nèi)和近緣種的）親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育分析、遺傳進(jìn)化、擴(kuò)散/傳播及昆蟲與環(huán)境的關(guān)系等方面的研究中起著重要的作用[13，15-16]。

本研究采用通用引物對(duì)癭蚊科3種昆蟲（麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊）的核糖體DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析，同時(shí)以我國4個(gè)地理種群的麥紅吸漿蟲為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增其ITS-1，并進(jìn)行序列的變異情況分析。希望本研究能夠?yàn)榻窈蟀`蚊科昆蟲的分類、物種鑒定、親緣關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析等方面的研究提供新的DNA分子標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

菊花癭蚊成蟲采自河南省溫縣，食蚜癭蚊成蟲由衡水田益生防有限責(zé)任公司提供，為室內(nèi)飼養(yǎng)的天敵產(chǎn)品。麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群的樣品分別為2012年4月-5月份期間采自河南省輝縣、河南省欒川縣、寧夏回族自治區(qū)銀川市和山西省臨汾市發(fā)生麥紅吸漿蟲地塊的土樣。將含有麥紅吸漿蟲幼蟲的土樣放于溫度（22±1）℃、相對(duì)濕度70%～75%，光周期L∥D=14 h∥10 h的條件下讓其羽化。收集剛剛羽化的成蟲，放于75%乙醇中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 昆蟲基因組DNA（gDNA）的提取

3種昆蟲基因組DNA的提取方法參照段云等[17]的方法。提取的總DNA用超純水溶解后，用0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的提取效果，然后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 核糖體DNA的PCR擴(kuò)增

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的雙翅目昆蟲核糖體DNA序列，設(shè)計(jì)1對(duì)用于擴(kuò)增癭蚊科昆蟲核糖體DNA序列的引物，Cec-F：5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，Cec-R：5′-ATGYAAATTYAGGGGGTAGTC-3′。同時(shí)設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增麥紅吸漿蟲ITS-1基因序列的引物，ITS-1F： 5′-GTCGTAACAAGGTTTCCGTAG-3′，ITS-1R： 5′-GATGTTCATGTGTCCTGCAGT-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

以提取的昆蟲總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，擴(kuò)增麥紅吸漿蟲ITS序列的樣品來自河南輝縣。反應(yīng)總體積為20 μL，包含10×buffer（Mg2+ free）2 μL，25 mmol/L Mg2+1.8 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL，上游引物（10 pmol/L）1 μL，下游引物（10 pmol/L）1 μL，超純水10.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）（大連TaKaRa公司）0.2 μL，含有20～40 ng DNA的模板1.5 μL。PCR反應(yīng)在SensoQuest LabCycler 2.2型PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min;95℃變性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min終止反應(yīng)。

電泳檢測(cè)：PCR反應(yīng)結(jié)束后，在8 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加入1.6 μL 6×DNA上樣緩沖液后，用1.0%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測(cè)序

利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收后的DNA連接到pMDTM19-T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽性轉(zhuǎn)化子后，將菌液送至生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群ITS-1的PCR產(chǎn)物，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，由生工生物工程（上海）有限公司完成PCR產(chǎn)物的純化及測(cè)序。

1.3.4 序列分析

所測(cè)序列通過Chromas軟件進(jìn)行讀取。在NCBI網(wǎng)站上（www.ncbi.nlm.nih.gov）利用BLAST軟件對(duì)獲得的ITS序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，排除有外源污染的序列，然后將序列提交GenBank，獲得GenBank登錄號(hào)。

利用MEGA 4.0軟件[18]對(duì)3條ITS序列（ITS-1和ITS-2）進(jìn)行序列比對(duì)分析，并輔以人工校正。然后進(jìn)行堿基組成、多態(tài)位點(diǎn)和遺傳距離分析;利用SSR Finder軟件（http：∥www.fresnostate.edu/ssrfinder/）對(duì)ITS序列進(jìn)行重復(fù)序列的在線查找，查找標(biāo)準(zhǔn)為：單核苷酸重復(fù)12次以上，二核苷酸重復(fù)6次以上，三核苷酸的重復(fù)5次以上，四核苷酸以上的重復(fù)4次以上。利用DnaSP v5軟件[19]和MEGA 4.0軟件對(duì)ITS-1在麥紅吸漿蟲種內(nèi)的遺傳變異情況進(jìn)行分析，分析內(nèi)容包括計(jì)算核苷酸變異位點(diǎn)（variable sites）、多態(tài)性位點(diǎn)（polymorphic sites）、簡約信息位點(diǎn)數(shù)（parsimony informative polymorphic sites）、單倍型多樣性（haplotype diversity）和核苷酸多樣性（nucleotide diversity）等。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS的PCR擴(kuò)增、克隆及序列分析

運(yùn)用擴(kuò)增癭蚊科昆蟲核糖體DNA的引物（Cec-F和Cec-R）對(duì)3種癭蚊科昆蟲的gDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后經(jīng)克隆、測(cè)序及序列分析，最終從麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊中各獲得一條長度為1 059、1 042 bp和1 073 bp的核DNA序列，其中包含18S rDNA（44 bp）、5.8S rDNA（121 bp）、28S rDNA（37 bp）、ITS-1（487～535 bp）和ITS-2（336～352 bp）的序列。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，從3種昆蟲中擴(kuò)增出的18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA序列都非常保守，同源性達(dá)100%。將這3條序列提交到GenBank，獲得GenBank登錄號(hào)為：MH734104—MH734106。序列的比對(duì)分析結(jié)果顯示，3種昆蟲的ITS（ITS1+ITS2）序列長度變化較大，菊花癭蚊的ITS序列的長度最短，為839 bp，食蚜癭蚊的ITS序列最長，為871 bp。ITS-1的片段長度在487～535 bp，其中來自菊花癭蚊的ITS-1序列最短（487 bp），來自食蚜癭蚊的ITS-1序列最長（535 bp）;ITS-2序列長度在336～352 bp，其中食蚜癭蚊的ITS-2序列最短（336 bp），菊花癭蚊的ITS-2序列最長（352 bp）。重復(fù)序列查找的結(jié)果表明，在麥紅吸漿蟲的ITS-1序列中含有一個(gè)重復(fù)序列（AAAT）4，在菊花癭蚊的ITS-1序列中含有一個(gè)重復(fù)序列（TTGTG）4，而在食蚜癭蚊中沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)序列。

2.2 ITS的堿基組成分析

堿基組成分析結(jié)果表明，在3種昆蟲的ITS序列中，A、G、C、T的百分含量都較穩(wěn)定，分別在330%～34.8%，15.4%～15.6%，11.7%～126%，37.5%～38.9%，在4種堿基中，T的含量最高。A+T的含量差異不大，除來自菊花癭蚊ITS-2序列的A+T含量與來自麥紅吸漿蟲和食蚜癭蚊的差異大于1%外，其他片段的A+T含量差異均不大。對(duì)ITS-1的堿基組成分析結(jié)果表明（表1），3種昆蟲的堿基A、G、C、T平均含量分別為34.4%、153%、11.4%和389%，A+T（73.2%）含量明顯高于G+C含量（26.8%）。對(duì)ITS2堿基組成分析結(jié)果表明（表2），堿基A、G、C、T平均含量分別為33.8%、158%、13.5%和37.0%，A+T（707%）含量明顯高于G+C含量（29.3%）。

2.3 ITS的序列比對(duì)分析

將從3種昆蟲中獲得的ITS全長序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列的同源性比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，來自麥紅吸漿蟲的ITS序列與GenBank上來自麥紅吸漿蟲的兩段序列（GAKJ01010562.1，長度為691 bp和GAKJ01010530.1，長度為303 bp）的同源性都為99%。來自菊花癭蚊的ITS-1與來自黑森癭蚊的ITS-1序列（AF488424）同源性為83%。來自麥紅吸漿蟲的ITS-2與來自癭蚊科Endaphis fugitiva的ITS-2序列（HQ599574）同源性為81%;來自食蚜癭蚊的部分ITS-2（330 bp）與來自癭蚊科E.fugitiva的部分ITS-2序列（HQ599574）同源性為84%。將來自3種昆蟲的ITS-1和ITS-2分別進(jìn)行兩兩序列的同源性比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列的同源性均較低（<80%）。

3種昆蟲的ITS序列（ITS-1和ITS-2）比對(duì)分析結(jié)果顯示（圖1），ITS序列長度上存在較大的差異;

蟲中沒有變化。對(duì)3種昆蟲的ITS-1序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并截取457 bp的同源片段（去掉插入/缺失），其中的變異位點(diǎn)數(shù)為146個(gè)（31.9%），包括67個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)、71個(gè)顛換位點(diǎn)及18個(gè)同時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換的位點(diǎn)。同樣對(duì)ITS-2序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析，并截取314 bp的同源片段（去掉插入/缺失），其中變異位點(diǎn)數(shù)為60個(gè)（19.1%），包括29個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)、19個(gè)顛換位點(diǎn)及12個(gè)同時(shí)發(fā)生轉(zhuǎn)換和顛換的位點(diǎn)。

2.4 麥紅吸漿蟲不同地理種群的ITS-1序列分析

以ITS-1F和ITS-1R為引物，從麥紅吸漿蟲的4個(gè)地理種群共88個(gè)樣品中均能擴(kuò)增出一條長度約600 bp的單一條帶，序列中包含部分18S rDNA，ITS1和5.8S rDNA。對(duì)4個(gè)地理種群的ITS-1序列進(jìn)行比對(duì)分析后，截取含有ITS-1的511 bp的對(duì)齊序列。序列比對(duì)的結(jié)果顯示（表3），在麥紅吸漿蟲的4個(gè)地理種群中共鑒定出4個(gè)變異位點(diǎn)，占所有堿基數(shù)的0.78%，其中包括3個(gè)簡約信息位點(diǎn)，1個(gè)自裔位點(diǎn)，并且其中有2個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生轉(zhuǎn)換，2個(gè)位點(diǎn)的堿基發(fā)生顛換。全部序列兩兩之間的同源性高達(dá)99%～100%。

經(jīng)DnaSP分析，在麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群中共檢測(cè)出7種單倍型?？?cè)后w單倍型多樣性指數(shù)（haplotype diversity， Hd）為0.654，核苷酸多樣性指數(shù)（nucleotide diversity， π）為0.001 8。各種群內(nèi)ITS-1單倍型數(shù)目變化范圍在2～6種不等，平均擁有單倍型4.25種。其中，欒川種群內(nèi)具有的單倍型種類最多，共檢測(cè)到6種單倍型，其次為輝縣種群，檢測(cè)到5種單倍型，而從銀川種群檢測(cè)出的單倍型數(shù)目最少，為2種單倍型。各地理種群ITS-1基因單倍型多樣性為0.311 7～0.796 5，平均為0.607 2，其中銀川種群的單倍型多樣性最低，欒川種群的單倍型多樣性最高。各種群的平均核苷酸多樣性π為0.001 6，在不同種群中π值的變化范圍在0.000 6～0.002 2之間，π值最小的為銀川種群，最大的為欒川種群。

對(duì)ITS-1基因的7種單倍型在麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群中的分布情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，hap1和hap3是4個(gè)種群的共享單倍型，其中hap1的分布范圍最廣（27.27%～81.82%），在4個(gè)種群中共出現(xiàn)45個(gè)（51.14%），其次是單倍型hap3共出現(xiàn)23個(gè)（26.14%），hap2共出現(xiàn)13個(gè)（14.77%），hap4出現(xiàn)2個(gè)，hap5出現(xiàn)3個(gè)，而hap6和hap7各出現(xiàn)1個(gè)。

采用MEGA 5軟件基于大復(fù)合概似法（maximum composite likelihood， MCL）模型和Kimura-2-Parameter （K2P）雙參數(shù)模型計(jì)算種群間遺傳距離（表4）。結(jié)果表明，麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群間的遺傳距離范圍為0.001 19～0.002 32，平均遺傳距離為0.001 84，其中欒川種群與輝縣種群的遺傳距離最大，為0.002 32;寧夏種群與輝縣種群間的遺傳距離最小，為0.001 19。

3 討論

昆蟲核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是位于核糖體大小亞基rRNA基因之間的區(qū)域，被5.8S rRNA基因分隔為ITS-1和ITS-2片段。通常認(rèn)為ITS區(qū)比rRNA基因有著更高的進(jìn)化率，種間的序列變異較大，可以為昆蟲種及種以上的分類鑒定提供依據(jù)。本研究采用癭蚊科昆蟲ITS序列的通用引物，從麥紅吸漿蟲、菊花癭蚊和食蚜癭蚊3種昆蟲中擴(kuò)增出全長的ITS序列，其中包括18S rDNA部分序列，58S rDNA，ITS1和ITS2全部序列及28S rDNA部分序列。同時(shí)對(duì)ITS-1基因片段在麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群中的遺傳變異情況進(jìn)行了分析。

對(duì)3種癭蚊科昆蟲核糖體DNA序列的分析結(jié)果顯示，3種昆蟲核糖體DNA序列的長度（1 061～1 073 bp）和堿基組成均存在一定的差異。本研究中ITS序列中包括ITS-1（487～535 bp）和ITS-2（336～352 bp）兩個(gè)部分。序列比較分析表明，ITS序列中存在206個(gè)堿基變異位點(diǎn)，其中包括96個(gè)轉(zhuǎn)換位點(diǎn)，80個(gè)顛換位點(diǎn)，30個(gè)位點(diǎn)既發(fā)生了轉(zhuǎn)換又發(fā)生了顛換，且序列中都存在堿基的插入/缺失。3種昆蟲ITS序列的4種堿基（A、G、C、T）的百分含量都較穩(wěn)定，并且A+T含量（≥69%）都明顯地高于G+C含量（≤31%），這一結(jié)果與鄒志文等[20]的研究結(jié)果相一致，即ITS基因序列含有較高的A、T含量。序列的同源性分析結(jié)果表明，ITS區(qū)（包括ITS-1+ITS-2）在3種昆蟲中的同源性均較低（<80%）。

對(duì)ITS-1序列在麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群中的變異情況的分析結(jié)果表明，共發(fā)現(xiàn)4個(gè)變異位點(diǎn)，并且序列長度比較保守，沒有發(fā)現(xiàn)堿基的插入或缺失?；贗TS-1序列對(duì)我國麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群間的遺傳關(guān)系的分析結(jié)果表明，ITS-1序列的單倍型種類和出現(xiàn)頻率在麥紅吸漿蟲4個(gè)地理種群中存在很大的差異。但遺傳距離的分析結(jié)果顯示，4個(gè)地理種群間的遺傳距離較小，表明種群間雖然存在一定程度的遺傳分化，但遺傳分化程度較低。Duan等[21]利用SSR標(biāo)記和線粒體DNA 標(biāo)記對(duì)麥紅吸漿蟲這4個(gè)地理種群的遺傳分化研究表明，這4個(gè)種群間存在明顯的遺傳分化。因此，本研究認(rèn)為ITS-1不適合作為麥紅吸漿蟲種下遺傳分化的分子標(biāo)記，這與王莉萍等[22]的研究結(jié)果表明rDNA-ITS-1序列不適合用于美洲斑潛蠅及其近緣種的種下遺傳分化的分子標(biāo)記的結(jié)果類似。

本研究通過對(duì)3種癭蚊科昆蟲核糖體DNA的研究及ITS-1在麥紅吸漿蟲種內(nèi)的遺傳變異情況分析，初步認(rèn)為ITS序列在癭蚊科種屬間存在較高的變異，可作為癭蚊科昆蟲系統(tǒng)發(fā)育研究及分類鑒定的分子標(biāo)記;ITS-1序列在麥紅吸漿蟲種內(nèi)非常保守，遺傳變異較小，不適合作為其種內(nèi)遺傳分化的分子標(biāo)記。到目前為止，有關(guān)癭蚊科昆蟲rDNA分子標(biāo)記的研究報(bào)道還很少。希望本研究能夠?yàn)榘`蚊科昆蟲的DNA分子標(biāo)記開發(fā)提供進(jìn)一步的補(bǔ)充。

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（責(zé)任編輯：田 喆）