汪生　陳冠軍　臧丹丹　胡江玲　錢成　馮蕊

摘要 [目的]建立了基于超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的非靶向代謝組學方法分析普洱生茶和普洱熟茶中醇溶性差異物質(zhì)。[方法]通過70%甲醇提取和液相色譜-高分辨質(zhì)譜分析，結合保留時間的規(guī)律和數(shù)據(jù)庫匹配鑒定物質(zhì)，依據(jù)正交偏最小二乘法-判別分析表明兩者間物質(zhì)存在顯著差異，結合模型的變量重要因子和非參數(shù)檢驗，篩選差異物質(zhì)。[結果]普洱生茶和普洱熟茶中共鑒定出100個化合物。通過統(tǒng)計分析，2種普洱茶中篩選出32個差異物質(zhì)，其中氨基酸類、嘌呤類、兒茶素類和沒食子兒茶素類等物質(zhì)在2組中的含量差異顯著。[結論]建立的方法為合理科學解釋普洱生茶和普洱熟茶功效提供一定的依據(jù)。

關鍵詞 普洱生茶;普洱熟茶;超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜;代謝組學

中圖分類號 TS 272.7文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）23-0226-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.23.059

Non-targeted Metabolomics Study for Differences in Methanol-Soluble Chemical Composition of Raw Pu-er Tea and Ripe Pu-er Tea by Using UPLC-HRMS

WANG Sheng1，2，CHEN Guan-jun1，2，ZANG Dan-dan1，2 et al

（1.The Center for Scientific Research of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032;2.Anhui Province Key Laboratory of Major Autoimmune Diseases，Hefei，Anhui 230032）

Abstract [Objective]To discover the methanol-soluble differential chemical compound in raw Pu-er tea and ripe Pu-er tea by a non-targeted metabolomics method based on UPLC-HRMS.[Method]After the liquid extraction，Ultra High Performance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry （UPLC-HRMS） was used for the data acquisition.The chemical identification was carried out by comparing with the known compounds in commercial and public databases.Multivariate analysis，Mann-Whitneg U test and orthogonal projections to latent structures-discrimination analysis （OPLS-DA） analysis were used to find and visualize differential chemical compound.[Result]100 compounds were tentatively identified in raw Pu-er tea and ripe Pu-er tea.Finally，32 compounds，among which，amino acids，purines，catechins，and epigallocins，were a significant difference between them.[Conclusion]This study demonstrates the potentials and power of metabolomics method to understand the chemical secrets of Pu-er tea，which could provide a scientific explanation for the benefit of different Pu-er tea.

Key words Raw Pu-er tea;Ripe Pu-er tea;UPLC-HRMS;Metabolomics

茶是世界上消費最廣泛的非酒精性飲料之一，具有巨大的經(jīng)濟、健康和文化價值[1]。普洱茶產(chǎn)自中國云南，目前常見的有普洱生茶和普洱熟茶[2-3]。普洱茶在中國有眾多的消費者，相關研究表明，普洱茶具有降血脂、降血糖、抗炎和神經(jīng)保護等作用，因此研究普洱茶中的化學物質(zhì)及其作用機制具有很大意義和價值[2，4-5]。普洱茶是一種獨特的微生物發(fā)酵茶，目前對普洱茶的相關研究報道很多，主要涉及普洱茶安全性（真菌毒素測定[6]和農(nóng)藥殘留定量[7]等）、茶葉物質(zhì)組成（靶標定量研究[8]和發(fā)酵過程中物質(zhì)變化[9]等）、發(fā)酵過程菌群變化[10-11]以及茶葉的抗炎免疫藥效學[12]等。

茶葉中的化學物質(zhì)是構成其獨特風味和功效的物質(zhì)基礎。普洱茶物質(zhì)組成研究主要分為香氣物質(zhì)和非揮發(fā)性物質(zhì)分析兩方面。香氣是普洱茶的重要品質(zhì)特征，相關研究[13-15]通過氣相色譜質(zhì)譜法（GC-MS）發(fā)現(xiàn)普洱茶中的香氣物質(zhì)主要是醇類、酮類、酯類、酸類、醛類、醚類、陳香成分和碳氫類物質(zhì)，為普洱茶的香氣物質(zhì)研究提供了充實的依據(jù)。普洱茶的獨特口感和奇特功效也是其廣受歡迎的原因，茶葉中的極性非揮發(fā)性物質(zhì)發(fā)揮了重要作用。有關普洱茶中極性物質(zhì)化學成分的研究很多，大多采用液相色譜（LC）或者與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）的方法。曾亮等[16]通過LC-MS法測定了不同貯藏時間普洱生茶水提物的特征性成分，共檢測到107種化合物;朱洪波等[17]通過純化的方法，從普洱茶水提物中分離鑒定出13種化合物;侯冬巖等[8]測定普洱生茶與普洱熟茶中原花青素含量;陳紅霞等[9]對普洱茶渥堆發(fā)酵中活性成分進行靶標測定。結合相關研究總結發(fā)現(xiàn)，普洱茶中主要含有兒茶素類、黃酮類、生物堿類等物質(zhì)，同時還有咖啡因、膳食纖維、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等[9，18]。

單變量統(tǒng)計分析是最簡單常用的統(tǒng)計學方法，常用變異倍數(shù)分析（fold change analysis，F(xiàn)C > 2）和t檢驗（P<0.05）在2組樣本之間得到差異化合物，綜合前面2種分析方法可以得到物質(zhì)的火山圖（volcano plot），來尋找潛在的差異物質(zhì)[19]。

綜合VIP值和火山圖（圖5）分析結果，得到最終的32種差異物質(zhì)，采用聚類熱圖（圖6）對2種普洱茶中差異物質(zhì)進行分析[20]。

研究結果表明，普洱生茶中含有豐富的氨基酸（茶氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、精氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等）類物質(zhì)、沒食子素類、兒茶素類和槲皮素類等物質(zhì)，與文獻報道相符[22-23]。在普洱熟茶中，富含嘌呤類（鳥嘌呤、副黃嘌呤和次黃嘌呤）物質(zhì)，研究結果和文獻報道相符[9]，從非靶標代謝組學研究思路，闡明了普洱生茶和普洱熟茶重要的活性物質(zhì)差異。

2.3 普洱生茶和普洱熟茶差異物質(zhì)的代謝通路分析

普洱生茶發(fā)酵制成普洱熟茶，主要是普洱茶渥堆發(fā)酵過程中眾多微生物發(fā)酵所致，主要涉及芽孢桿菌屬、腸球菌屬、青枯菌屬、酵母菌和黑曲霉等[24-26]。通過非靶標代謝組學研究思路，探究出普洱生茶和普洱熟茶中差異的化學物質(zhì)，利用MetaboAnalyst的通路分析功能，通過差異代謝物的KEGG ID進行通路富集分析。由圖7可知，32種差異代謝物參與的代謝通路有29條。p<0.05且impact>0.2的代謝通路認為，相關性較強的通路共有2條，分別是氨酰tRNA生物合成通路（aminoacyl-tRNA biosynthesis）和丙氨酸-天門冬氨酸-谷氨酸代謝通路（alanine，aspartate and glutamate metabolism）。參與氨酰tRNA生物合成通路和丙氨酸-天門冬氨酸-谷氨酸代謝通路有10種物質(zhì)，分別為天冬酰胺、組氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、絲氨酸、異亮氨酸、色氨酸、酪氨酸和谷氨酸。以上研究表明，普洱生茶在渥堆發(fā)酵過程中，氨基酸類物質(zhì)被微生物消耗，可能是用于微生物體內(nèi)的氨酰tRNA生物合成，參與微生物的蛋白質(zhì)生物合成。

3 結論與討論

（1）采用70%甲醇提取普洱生茶和普洱熟茶后進行相關研究，該提取法主要用于提取極性較強的物質(zhì)，不能很好地提取和鑒定弱極性的化合物，結合GC-MS方法可得到更加全面的物質(zhì)種類信息;限于實際條件的影響，研究的普洱生茶和普洱熟茶非同一廠家生產(chǎn)。不同的產(chǎn)地、時間和制作工藝，可能會導致茶葉本身物質(zhì)含量和種類存在差異;茶氨酸在普洱生茶中含量極高，但是在普洱熟茶中幾乎檢測不到，有關機制尚不明確。據(jù)相關文獻報道，茶氨酸具有很好的抗氧化、抗腫瘤和保健等功效，有關普洱茶發(fā)酵過程中茶氨酸的轉(zhuǎn)化機制有待進一步深入研究。

（2）采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀結合非靶標代謝組學研究策略，分析了普洱生茶和普洱熟茶中醇溶性差異物質(zhì)種類及其相對含量。共定性出100種化合物，其中普洱生茶和普洱熟茶中有32種物質(zhì)含量存在顯著差異。2組茶葉中主要含有咖啡因、山萘酚、槲皮素等化學物質(zhì)，普洱生茶較普洱熟茶中含有豐富的氨基酸類物質(zhì)、沒食子素類、兒茶素類和槲皮素類等物質(zhì);渥堆發(fā)酵得到的普洱熟茶中富含嘌呤類物質(zhì)。通過差異代謝物通路富集分析，普洱熟茶中氨基酸類物質(zhì)顯著減少，可能是氨基酸

在普洱茶渥堆發(fā)酵過程中參與了微生物的蛋白質(zhì)合成。該研究為科學合理解釋普洱茶發(fā)酵工藝和茶葉功效提供了理論依據(jù)，同時也為進一步研究普洱茶提供了新的思路和方法。

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作者簡介汪生（1992—），男，安徽銅陵人，碩士，助理實驗師，從事藥物分析學相關研究。*通信作者，助理實驗師，碩士，從事藥學相關研究。

收稿日期 2020-05-02;修回日期 2020-06-28