楊琴,劉明軍,張桂香，楊建杰,王海峰

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070；2甘南藏族自治州農(nóng)業(yè)科學研究所，甘肅 合作 747000)

絮緣蘑菇Agaricussubfloccosus(Langs)Pilat在分類上隸屬于傘菌目Agaricales、傘菌科Agaricaceae、蘑菇屬Agaricus，與雙孢蘑菇Agaricusbisporus同屬于Duploannulatae組[1-2]，作為一種食用菌，具有潛在的栽培價值[3-4]，是進行種質(zhì)資源收集和開發(fā)利用的理想材料.野生食用菌的分離鑒定、生物學特性研究是其開發(fā)運用的首要環(huán)節(jié).傳統(tǒng)的野生食用菌分類以形態(tài)觀察為主，由于子實體形態(tài)易受到產(chǎn)地、環(huán)境和生長階段等外界因素的影響，給鑒定增加了不小的難度.隨著分子生物學的快速發(fā)展，野生食用菌的分類鑒定變得快速、準確，李賽飛等[5]通過形態(tài)鑒定和ITS鑒定將我國的蘑菇屬真菌種類增加到57種，近年來發(fā)表的20余個真菌新屬，絕大多數(shù)屬的建立也均有分子證據(jù)支持[6].

絮緣蘑菇首次由真菌學家Lange對其進行了描述[7]，而相關(guān)研究則到了20世紀90年代，Noble等[3]對不同來源的絮緣蘑菇菌株進行了比較，發(fā)現(xiàn)絮狀蘑菇具有比雙孢蘑菇更濃郁的氣味、更復雜的菌環(huán)、更多的菌蓋絮狀物、更鮮明的傷變反應(yīng)，菌蓋邊緣通常也會形成淺層放射狀裂隙；絮狀蘑菇不同菌株之間存在菌絲長速、產(chǎn)量方面的差異顯著，但其孢子大小則表現(xiàn)出較高的一致性，比雙孢蘑菇略小一些[8]，可以作為分類的重要參考指標；Kerrigan等[9]從絮緣蘑菇子實體微觀形態(tài)、平板菌絲生長情況以及基因型(采用RFLP技術(shù))等角度入手研究了絮緣蘑菇復合群遺傳結(jié)構(gòu)，將絮緣蘑菇劃分成低海拔群(≤200 m)和高海拔群(500～700、1 100～1 600 m).除此之外，絮緣蘑菇僅出現(xiàn)在蘑菇屬不同種類的微觀形態(tài)比較[10-11]和蘑菇屬系統(tǒng)發(fā)育重建研究[8,12]之中，值得一提的是Buchalo等.[10]發(fā)現(xiàn)老化的菌絲體表面通常會形成棒狀晶體，有時也會形成頭發(fā)絲狀晶體，而晶體的形成則是一些大型真菌的特有特征.我國有關(guān)絮緣蘑菇的報道僅有南岳山自然保護區(qū)分布記載[13]，沒有生物學特性相關(guān)研究.本文對采集于祁連山國家級自然保護區(qū)西水自然保護站大野口排露溝流域(N 38°16′～38°33′，E 100°13′～100°16′)海拔2 900 m青海云杉林地中的野生絮緣蘑菇進行分離，并對其分離純化物進行ITS鑒定和生物學特性研究，旨在篩選適宜菌絲體生長的營養(yǎng)條件和環(huán)境條件，以期為絮緣蘑菇的開發(fā)利用提供參考資料.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 采集祁連山國家級自然保護區(qū)西水自然保護站大野口排露溝流域海拔2 900 m青海云杉林地中的野生絮緣蘑菇，經(jīng)組織分離、純化獲得，編號為XSLQ 12.

1.1.2 培養(yǎng)基葡萄糖20 g，蛋白胨2 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，瓊脂18 g，水1 000 mL.

1.2 試驗方法

1.2.1 野生絮緣蘑菇的ITS鑒定 將菌株XSLQ12接種于PDA平板培養(yǎng)基中，25 ℃下暗光培養(yǎng)，待菌絲長滿平板后，刮取菌落菌絲進行DNA提取、PCR擴增、純化、測序、BLAST比對(此過程由蘇州金唯智生物科技有限公司完成)，下載相似性高的ITS序列，用Clustalx進行相似性多序列比對，用MEGA 5.05軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復抽樣1 000次分析系統(tǒng)樹各分枝的置信度.

1.2.2 野生絮緣蘑菇生物學特性研究 在培養(yǎng)基組成如1.1.2、培養(yǎng)基pH值自然、培養(yǎng)溫度25 ℃的特定條件下，保持其它因素不變，只改變培養(yǎng)基碳源、氮源、pH值、培養(yǎng)溫度4個因素中的其中一個，觀測不同培養(yǎng)下的菌絲生長情況.碳源篩選有葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、可溶性淀粉7種，氮源篩選有酵母膏、蛋白胨、黃豆粉、硫酸銨、亞硫酸鈉5種，pH值篩選有4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0共6個，培養(yǎng)溫度篩選有10、15、20、25、30、35 ℃共6個，以菌絲長速為主，綜合考慮菌絲長勢、菌絲形態(tài)，進行適宜碳源、氮源、pH值、溫度的篩選，每試驗重復3次.

1.2.3 測定方法 取生長良好的PDA平板菌落，用直徑0.5 cm的打孔器取同一直徑內(nèi)的菌塊，接入相應(yīng)的培養(yǎng)基中央進行培養(yǎng)，菌絲萌發(fā)后，采用十字劃線法測定菌落大小，每隔24 h測量1次，記錄菌絲長勢、菌絲形態(tài)，計算菌絲長速.

2 結(jié)果與分析

2.1 野生絮緣蘑菇的鑒定

菌株XSLQ 12的ITS1/ITS4引物區(qū)段序列擴增長度為709 bp(圖1)，測序結(jié)果登錄NCBI與GenBank中已知菌株進行BLAST比對，覆蓋度99%以上、相似性為99%的菌株有5個，分別為4個Agaricussubfloccosus、1個Agaricusagrinferus，覆蓋度99%以上、相似性為98%的菌株較多，多數(shù)為Agaricusbisporus、個別為Agaricusdevoniensis.基于供試菌株及上述相似度高的ITS序列共計13個，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2).從系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，菌株XSLQ 12與Agaricussubfloccosus聚為一支，離Agaricusbisporus、Agaricusdevoniensis較遠，結(jié)合菌株XSLQ 12與菌株RWK1441的最高相似比為695/704(99%)，可以確定供試菌株XSLQ 12為絮緣蘑菇Agaricussubfloccosus.

M：Marker；Y：陰性對照；1：以XSLQ12基因組DNA為模板的ITS擴增條帶.M：Maker；Y：Negative control；1：Its amplified band using XSLQ12 genemic DNA as template.圖1 ITS片段的擴增Figure 1 Amplification of ITS fragments

圖2 野生絮緣蘑菇及其相似物種ITS序列構(gòu)建的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree of NJ based on ITS sequences of wild Agaricus subfloccosus and ITS analogs

2.2 不同碳源對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

由表1、圖3可知，野生絮緣蘑菇菌絲能夠利用的碳源譜較為廣泛，且不同碳源對菌絲長速的影響差異不大，其中果糖、蔗糖、可溶性淀粉三者的菌絲生長較快，長速均大于0.850 cm/d，三者之間無顯著差異；葡萄糖、乳糖、麥芽糖的菌絲生長較慢，長速在0.757～0.769 cm/d之間.從表1、圖4可知，葡萄糖、果糖作碳源時菌絲濃密、毛氈狀，乳糖、甘露醇、可溶性淀粉作碳源時菌絲較密，而蔗糖、麥芽糖作碳源時菌絲稀疏、毛絮狀.綜合考慮菌絲長速、長勢，可以確定果糖是野生絮緣蘑菇XSLQ 12菌株的適宜碳源.

表1 不同碳源對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

圖3 不同碳源野生絮狀蘑菇菌絲生長曲線Figure 3 The curve of mycelium growth of Agaricus subfloccosus under different carbon source

圖4 不同碳源野生絮緣蘑菇菌絲生長情況Figure 4 Mycelial growth of Agaricus subfloccosuse under different carbon compounds

2.3 不同氮源對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

不同氮源對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響作用很大.從菌絲長速來看，菌絲在黃豆粉、酵母膏、硫酸銨上生長較快，平均長速大于0.832 cm/d，且三者之間無顯著差異，其次為蛋白胨，平均長速為0.719 cm/d，菌絲在亞硝酸鈉上生長較慢，平均長速為0.477 cm/d；菌絲長速在黃豆粉上提高最快，從24 h的最慢至48 h時已位居第一(表2、圖5).從菌絲長勢來看，酵母膏、蛋白胨為氮源時菌絲長勢較好、氣生菌絲密；硫酸銨，黃豆粉、亞硫酸鈉作氮源時菌絲長勢很差、氣生菌絲稀疏(表2、圖6).綜合菌絲長速和長勢，確定野生絮緣蘑菇XSLQ 12菌株的最適氮源為酵母膏.

表2 不同氮源對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

圖5 不同氮源野生絮狀蘑菇菌絲生長曲線Figure 5 The curve of mycelium growth of Agaricus subfloccosus under different nitrogen source

圖6 不同氮源野生絮緣蘑菇菌絲生長情況Figure 6 Mycelial growth of Agaricus subfloccosuse under different nitrogen compounds

2.4 不同pH值對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

從圖7可知，不同pH值的野生絮緣蘑菇菌絲生長曲線可分為兩組，第一組為pH 4、pH 5、pH 6，曲線迅速上升，第二組為pH 7、pH 8、pH 9，曲線平緩上升，且pH 6、pH 7兩曲線的上升幅度差異很大，結(jié)合表3可知，菌絲平均生長速率從0.811 cm/d迅速降低至0.557 cm/d，說明酸性環(huán)境較中性偏堿環(huán)境更有利于菌絲生長；pH 4、pH 5兩曲線貼合度高，菌絲平均長速分別為0.874 、0.866 cm/d，二者間無顯著差異，此情況亦存在于pH 8、pH 9兩曲線之間，說明野生絮緣蘑菇XSLQ 12菌株對過酸、過堿環(huán)境有一定的耐受力.從表3、圖8可知，不同pH值對菌絲長勢的影響較小，所有pH值的菌絲均呈毛絮狀，其中pH5、pH6菌絲略顯濃密些，因此，野生絮緣蘑菇XSLQ 12菌株的最適pH值為5.

圖7 不同pH值野生絮狀蘑菇菌絲生長曲線Figure 7 The curve of mycelium growth of Agaricus subfloccosus under different temperture

圖8 不同pH值下野生絮緣蘑菇菌絲生長情況Figure 8 Mycelial growth of Agaricus subfloccosuse under different pH Value

表3 不同pH值對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

2.5 不同溫度對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

不同溫度下野生絮緣蘑菇XSLQ12菌株的菌絲萌發(fā)時間、菌絲生長曲線上升幅度差異均很大，說明溫度對菌絲生長速率的影響較大.具體表現(xiàn)為：當溫度≤20 ℃時，隨著溫度的升高，菌絲萌發(fā)速度、生長速度逐漸提高；當溫度為25 ℃時，菌絲萌發(fā)時間縮短為24 h，菌絲長速提高到0.754 cm/d，雖與20 ℃下的菌絲長速相當，但其菌絲濃密、潔白；當溫度>25 ℃時，隨著溫度的升高，菌絲萌發(fā)速度、生長速度迅速下降，30 ℃時菌絲萌發(fā)時間延長為96 h、長速降低為0.080 cm/d，35 ℃時菌絲停止生長(表4、圖9～10)，說明野生絮緣蘑菇菌絲適宜在中低溫環(huán)境下生長，高溫對菌絲的影響作用很大.菌絲長速(y)與溫度(x)間的函數(shù)關(guān)系為：

y=-0.000 5x3+0.022 9x2-0.301 5x+1.461 7

R=0.999 8

3 討論

在參與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的絮緣蘑菇菌株中，菌株RWK1441、RWK1994、RWK1993三者遺傳距離近，菌株FS5、RWK1397二者遺傳距離近，XSLQ 12則相對較遠，這與其發(fā)生地海拔有很大關(guān)系，因為在森林生態(tài)系統(tǒng)中，海拔梯度的變化會導致溫度、光照、水分等多種環(huán)境因子的變化[14]，進而影響野生菌的生長發(fā)育.菌株FS5、RWK1397采集于低海拔[3]，菌株RWK1441采集于海拔1 600 m[9]，菌株XSLQ 12采集于海拔2 900 m.Kerrigan等[9]在研究絮緣蘑菇復合群遺傳結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，高海拔(500～700、1 100～1 600 m)、低海拔(≤200 m)兩群體間形態(tài)差異小，但其培養(yǎng)特性、基因型差異很明顯，此觀點在后來的蘑菇屬孢子繁育系統(tǒng)[15]以及蘑菇屬系統(tǒng)發(fā)育重建和修訂研究[8]中均得以證明.

表4 不同溫度對野生絮緣蘑菇菌絲生長的影響

圖9 不同溫度對野生絮緣蘑菇菌絲長速的影響Figure 9 Effect of different temperture on mycelium growth of Agaricus subfloccosuse

圖10 不同溫度野生絮緣蘑菇菌絲生長情況Figure 10 Mycelial growth of Agaricus subfloccosuse under different temperatures

絮緣蘑菇菌株XSLQ 12在菌絲生長階段最適碳源為果糖，最適氮源為酵母膏，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃，最適pH值為5.0，與梁倩倩[16]報道的絮緣蘑菇最佳碳源蔗糖、最佳氮源硝酸鉀、最佳溫度16 ℃，最佳pH 6不一樣，但與同一采集地的雙孢蘑菇[17]存在相似之處，二者的最適溫度均為25 ℃、二者在pH4～5、8～9范圍內(nèi)都能生長，這一點與梁倩倩[16]報道的絮緣蘑菇、胡日瓦[18]報道的丁香蘑菇在pH>9的環(huán)境下停止生長不一樣，均表現(xiàn)出了對過酸、過堿環(huán)境的耐受力，二者的自然發(fā)生地土壤為森林灰褐土、堿性、測定數(shù)pH為8.05[19-20].

絮緣蘑菇菌株XSLQ 12在適宜的條件下其菌絲長速為0.754～0.899 cm/d，比梁倩倩[16]報道的菌絲長速(0.124～0.150 cm/d)和Kerrigan等[9]報道的菌絲長速(高海拔，0.082～0.089 cm/d；低海拔，0.046～0.067 cm/d)均要快很多，也快于同一采集地的野生雙孢蘑菇菌絲長速(0.350～0.459 cm/d)[17]，菌株XSLQ 12在菌絲生長方面具有一定的優(yōu)勢.

4 結(jié)論

采集于祁連山國家自然保護區(qū)排露溝流域海拔2900 m青海云杉林中的野生子實體經(jīng)組織分離、純化得菌株XSLQ 12，此菌株的ITS1/ITS4引物區(qū)段序列擴增長度為709 bp，擴增產(chǎn)物經(jīng)BLAST比對、系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建確定XSLQ 12菌株為絮狀蘑菇Agaricussubfloccosus.

絮緣蘑菇菌株XSLQ 12在菌絲生長階段能夠利用單糖、雙糖、多糖及糖醇，以果糖為其最適碳源；能夠利用復合氮、無機氮，以酵母膏為其最適氮源；嗜好酸性環(huán)境、最適pH值為5.0，對過酸、過堿環(huán)境有一定的耐受力；適宜在中低溫環(huán)境下生長，最適培養(yǎng)溫度為25 ℃；在最適培養(yǎng)條件下，菌株XSLQ 12在菌絲生長方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢.