羅琰，高博，董和，蒙琦，王繼卿

(1．甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所，甘肅 平?jīng)?744000；2．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophin，NTF)家族是由靶細(xì)胞分泌合成并經(jīng)神經(jīng)突起逆向轉(zhuǎn)運(yùn)至胞體而發(fā)揮作用的一類小分子蛋白，包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(neurotrophin 3，NTF3)和神經(jīng)營養(yǎng)因子4(neurotrophin 4，NTF4)[1].1990年，Ernfors 等[2]首先用基因克隆擴(kuò)增的方法發(fā)現(xiàn)了NTF3基因.研究表明其功能廣泛，在哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)的分化與增殖、生理功能調(diào)控及損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用[3].但也有研究報(bào)道NTF3基因可能與公豬性機(jī)能發(fā)育、性成熟、生精作用及雄性不育等生理過程密切相關(guān).

近幾年來人們對(duì)公豬繁殖性能的遺傳機(jī)理研究越來越重視，已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).Ding等[4]通過對(duì)不同日齡杜洛克和梅山公豬的睪丸組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)NTF3基因在不同品種公豬以及同一品種公豬的不同時(shí)期之間均有差異表達(dá).因此可以推測NTF3基因可能對(duì)雄性性機(jī)能發(fā)育和生精作用具有極其重要的調(diào)控功能.研究發(fā)現(xiàn)，NTF3基因可在支持細(xì)胞中表達(dá)，且是SRY誘導(dǎo)的前體支持細(xì)胞在雄性性別分化中從中腎細(xì)胞遷移至睪丸過程中的化學(xué)誘導(dǎo)劑[5]，而這種細(xì)胞遷移是睪丸索形成早期形態(tài)學(xué)上的一個(gè)關(guān)鍵過程[5-6].Barrionuevo等[7]也認(rèn)為NTF3基因的表觀突變(甲基化)與少量精液參數(shù)或與雄性不育相關(guān).然而目前關(guān)于NTF3基因相應(yīng)的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，對(duì)豬NTF3基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控方面的研究還未見報(bào)道.

真核生物基因表達(dá)量受多個(gè)水平的調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是最為重要的一步，其中關(guān)于啟動(dòng)子的研究最多.啟動(dòng)子是位于基因5′端上游的一段DNA序列，能特異性識(shí)別和結(jié)合RNA聚合酶并使之活化，從而起始轉(zhuǎn)錄[8-9].因此，對(duì)于啟動(dòng)子的深入研究有助于我們了解基因的結(jié)構(gòu)、功能及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制.本研究對(duì)豬NTF3基因的啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增克隆，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測分析，初步探索了豬NTF3基因啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)，以期為下一步構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組載體及檢測豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為深入研究豬NTF3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

采集3頭健康的杜洛克豬新鮮血液，加入抗凝劑，-20 ℃保存，用于DNA提取.

1.2 主要試劑

DL2000 DNA Marker、2×ES Taq Master Mix、膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；T4DNA Ligase、載體pMD18-T Vector(TaKaRa公司)；菌株DH5α(transgene公司)；DNA提取試劑盒、去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒(Endo-free Plasmid Mini KitⅡ)(Omega公司).

1.3 豬基因組DNA的提取

血液DNA提取參照DNA提取試劑盒(Omega公司)說明書進(jìn)行.

1.4 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)基因數(shù)據(jù)庫中豬NTF3基因(Gene ID：100144493)的參考序列，以5′UTR上游序列約1 730 bp為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1).引物合成由上海生工生物工程有限公司完成.

表1 啟動(dòng)子擴(kuò)增引物

1.5 豬NTF3基因啟動(dòng)子的擴(kuò)增和克隆

以杜洛克豬基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增NTF3基因啟動(dòng)子序列.PCR擴(kuò)增體系：模板DNA 1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，2×ES Taq Master Mix 12.5 μL，無菌去離子水9.5 μL.PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 S，58 ℃退火30 S，72 ℃延伸2 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用膠回收試劑盒回收目的片段，連接到pMDl8-T Vector載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDl8-T-NTF3，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)過夜，菌液PCR鑒定后篩選陽性克隆送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測序.利用DNAMAN軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定序列的正確性.

1.6 生物信息學(xué)預(yù)測分析

利用生物信息學(xué)分析軟件(表2)預(yù)測豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件(核心活性區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、CpG島以及TATA-box、CAAT-box等)，并將結(jié)果進(jìn)行分析.

表2 生物信息學(xué)分析軟件

2 結(jié)果與分析

2.1 豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)序列的擴(kuò)增和克隆

通過PCR擴(kuò)增出豬NTF3基因啟動(dòng)子5′端上游約1 730 bp的片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其結(jié)果與預(yù)期片段大小一致(圖1).切膠回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、菌液PCR鑒定，菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與之前片段大小相一致，表明重組克隆載體pMDl8-T-NTF3構(gòu)建成功.

2.2 豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)序列生物信息學(xué)分析

對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，目的片段大小為1 745 bp，去除21 bp重疊序列后，剩余1 724 bp為本次試驗(yàn)獲得的豬NTF3基因啟動(dòng)子序列，測序結(jié)果見圖2.該序列中各堿基組成存在差別，GC含量相對(duì)較高，占52.49%，AT含量占47.51%，相差約5%(表3).通過生物信息學(xué)軟件分析發(fā)現(xiàn)，豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)5′端-439 bp和-750 bp處存在2個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)，并檢測到1個(gè)TATA-box、1個(gè)CAAT-box、2個(gè)GC-box、3個(gè)GT-box和1個(gè)起始密碼子(圖2)，且這些元件均位于起始密碼子上游-1.4 kb范圍內(nèi).

M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：PCR產(chǎn)物.M：DNA marker；1～2：PCR products.圖1 NTF3基因啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR amplification of NTF3 gene promoter

運(yùn)用啟動(dòng)子預(yù)測軟件Neural Network Promoter Prediction進(jìn)一步分析，可預(yù)測出豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)潛在的核心活性區(qū)域(表4).一般認(rèn)為CpG島大于100 bp，且GC含量大于50%，本試驗(yàn)使用Methprimer軟件預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)目的基因NTF3啟動(dòng)子區(qū)不存在CpG島(圖3).

表3 豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)堿基組成

A：TATA框；B：CAAT框；C：GC框；D：GT框；E：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)；F：起始密碼子.A：TATA-box；B：CAAT-box；C：GC-box；D：GT-box；E：Transcription start site；F：Initiation codon.圖2 豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)序列與結(jié)構(gòu)Figure 2 Sequence and structure in the the promoter region of porcine NTF3 gene

表4 軟件預(yù)測的豬NTF3基因啟動(dòng)子核心活性區(qū)域

通過在線軟件TFSEARCH和AliBaba2.1預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，所獲的豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)存在多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子作用元件，如GATA-1、GATA-2、SRY、Sp1、C/EBPβ、AmL-1a、NF-1、MZF1、NF-kappaB、AP-1、YY1和MyoD等識(shí)別位點(diǎn)，其中，GATA-1、SRY、Sp1家族蛋白和C/EBPβ的結(jié)合位點(diǎn)頻率較高(表5).

圖3 CpG島預(yù)測結(jié)果Figure 3 CpG island prediction results NTF3 gene

表5 豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)主要轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

研究報(bào)道，NTF3基因可能對(duì)公豬性機(jī)能發(fā)育、性成熟、生精調(diào)節(jié)、生殖細(xì)胞的增殖與存活以及雄性不育等方面具有重要的調(diào)控作用[10].胎兒支持細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子NTF3對(duì)中腎細(xì)胞起作用，并控制它們遷移入性腺[11].Ding等[4]采用Western-blot檢測了NTF3在不同日齡杜洛克和梅山公豬睪丸中的蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)NTF3的表達(dá)可能與公豬睪丸的成熟過程有關(guān).Clement等[12]研究結(jié)果顯示，在雄性性腺性別分化時(shí)，SRY可在體外刺激下結(jié)合到NTF3啟動(dòng)子上與之相互作用，而SRY能夠啟動(dòng)睪丸發(fā)育的過程，這表明NTF3基因是SRY下游的一個(gè)直接靶基因.Cupp和Robinson等[13-14]研究也發(fā)現(xiàn)SRY和SOX9對(duì)NTF3基因有直接調(diào)節(jié)作用.基因表達(dá)調(diào)控中首要和重要的階段是轉(zhuǎn)錄起始，而轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的實(shí)質(zhì)是通過影響相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子和上游調(diào)控序列的相互作用來調(diào)控目的基因的表達(dá).然而關(guān)于豬NTF3基因啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)、功能和調(diào)控機(jī)理等尚未見報(bào)道.因此，本研究對(duì)豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)的序列與結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，有助于闡明其功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步揭示公豬性機(jī)能發(fā)育和生精調(diào)節(jié)的分子機(jī)理與轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定理論基礎(chǔ).目前，準(zhǔn)確率高的生物信息學(xué)分析軟件不斷涌現(xiàn)，在基因5′調(diào)控區(qū)啟動(dòng)子的分析和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測等方面發(fā)揮重要作用.

真核生物啟動(dòng)子主要包括TATA-box、起始子、GC-box、CAAT-box等作用元件，其中TATA-box和起始子又稱為核心啟動(dòng)子[15]，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有內(nèi)在的聯(lián)系，并在轉(zhuǎn)錄的正確起始中發(fā)揮重要作用.本試驗(yàn)預(yù)測的豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)序列的TATA-box(ATAAAA)位于-366 bp～-361 bp，并不符合真核生物啟動(dòng)子典型的5′-TATA[A/T]A[A/T]-3′序列模式，可見，豬NTF3基因的啟動(dòng)子和大多數(shù)哺乳動(dòng)物的類似，都沒有典型的TATA-box.TATA-box雖是構(gòu)成真核生物典型的核心啟動(dòng)子元件之一，但TATA-box也并不總是存在于一個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)域[16].對(duì)于沒有TATA-box的啟動(dòng)子來說，則需要Sp1結(jié)合于GC-box來啟動(dòng)基因的轉(zhuǎn)錄[17].GC-box有2個(gè)拷貝(GGCGGG)，位于CAAT框的兩側(cè)，是一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，有激活轉(zhuǎn)錄的功能.約有47.3%的真核生物啟動(dòng)子序列中至少有1個(gè)GC-box[18].本試驗(yàn)預(yù)測的2個(gè)GC-box(GGCCC)分別位于-1 364 bp～-1 360 bp和-913 bp～-909 bp處，與典型的GC-box有較高的同源性，且正好分布于CAAT-box兩側(cè).GC-box是轉(zhuǎn)錄因子Spl的經(jīng)典結(jié)合位點(diǎn)，因此推斷其可能激活NTF3基因的轉(zhuǎn)錄.CAAT-box是真核生物基因常有的調(diào)節(jié)區(qū)，多位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約-80bp處，但其距離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的遠(yuǎn)近對(duì)其作用影響不大，也可能是RNA聚合酶的一個(gè)結(jié)合處，控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，可增加啟動(dòng)子的強(qiáng)度[19].本試驗(yàn)獲得的1個(gè)CAAT-box(CAATGG)位于-1 120 bp～-1 115 bp，距離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)較遠(yuǎn)，是否能夠增強(qiáng)豬NTF3基因的轉(zhuǎn)錄效率，還有待進(jìn)一步研究.CpG島是表觀調(diào)控的重要組成之一，在調(diào)控方面發(fā)揮重要作用.一般情況下，CpG島主要位于基因的啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，約有60%以上基因的啟動(dòng)子含有CpG島.但王飛等[20]在‘大白豬’ATK3基因啟動(dòng)子中并未發(fā)現(xiàn)CpG島，胡慧艷等[21]也發(fā)現(xiàn)豬StAR基因啟動(dòng)子中不含有CpG島.可見不是所有基因啟動(dòng)子都存在CpG島，本研究中NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)未發(fā)現(xiàn)CpG島，這一結(jié)果將為后續(xù)從甲基化水平調(diào)控基因表達(dá)和驗(yàn)證功能奠定基礎(chǔ).

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測的豬NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)包含GATA-1、GATA-2、SRY、Sp1、C/EBPβ、AmL-1a、YY-1、NF-kappaB、NF-1和MZF1等多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn).轉(zhuǎn)錄因子是基因表達(dá)調(diào)控過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它與RNA聚合酶Ⅱ形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體，共同參與轉(zhuǎn)錄起始過程[22].SRY在睪丸中特異性表達(dá)[23]，是睪丸中腎細(xì)胞遷移和精索形成的必需因素之一[11,24].GATA-1可通過與啟動(dòng)子中(A/T)GATA(A/G)模序結(jié)合后激活基因的轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞分化和增殖中起重要作用[25].Spl是哺乳動(dòng)物基因轉(zhuǎn)錄活化的必須因子，可通過蛋白質(zhì)C端的鋅指結(jié)構(gòu)識(shí)別啟動(dòng)子上的GC/GT-box發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用[26]，其結(jié)合位點(diǎn)在轉(zhuǎn)錄激活的結(jié)構(gòu)域中分布非常廣泛[27-28].本研究在NTF3基因啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)多個(gè)Sp1的結(jié)合位點(diǎn)，這與前人的研究結(jié)果一致.此外，Spl對(duì)哺乳動(dòng)物的大量基因具有調(diào)控作用[29]，且TBP、YY1等多種轉(zhuǎn)錄因子可以參與Spl的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)[30].有研究報(bào)道，YYl和C/EBPβ參與調(diào)控哺乳動(dòng)物卵泡的成熟、排卵及初情期啟動(dòng)等繁殖活動(dòng)[31]，且在初情期啟動(dòng)過程中，YYl可結(jié)合在表達(dá)上調(diào)基因的啟動(dòng)子上[32].C/EBP轉(zhuǎn)錄因子家族具有募集RNA聚合酶復(fù)合體并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的能力[33].Masakiyo等[34]證實(shí)了C/EBPβ能夠單獨(dú)結(jié)合于HCE1A1基因啟動(dòng)子的相應(yīng)反應(yīng)元件上激活啟動(dòng)子并上調(diào)其活性.而Pitarque等[35]發(fā)現(xiàn)C/EBPβ可與CEBP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并下調(diào)CYP2A6啟動(dòng)子的活性.由此可見，轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合能力也能夠影響基因的表達(dá)水平.

4 結(jié)論

通過本研究結(jié)果可以初步認(rèn)為，克隆出的長度為1 724 bp的豬NTF3基因5′側(cè)翼序列是一個(gè)具有非典型的TATA-box、GC-box和CAAT-box的真核生物啟動(dòng)子，有2個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，可能是通過GC-box對(duì)轉(zhuǎn)錄的激活以及CAAT-box控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率來起始轉(zhuǎn)錄過程.但本序列是否具有啟動(dòng)子活性、預(yù)測的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是否正確以及本啟動(dòng)子區(qū)序列如何調(diào)控豬NTF3基因的轉(zhuǎn)錄等問題，仍需通過構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因重組載體，定點(diǎn)突變、缺失及染色質(zhì)免疫沉淀等方法進(jìn)一步驗(yàn)證和深入研究.