王裕鐵

（臨沭縣畜牧發(fā)展促進(jìn)中心，山東臨沭 276700）

山羊痘在羊群中的爆發(fā)率為50～80%之間，針對(duì)易感羊群致死率可達(dá)到58%甚至75%左右。由于山羊痘病毒毒性較強(qiáng)，一旦感染治愈率極低，不但會(huì)對(duì)羊群品質(zhì)帶來(lái)重大影響，而且當(dāng)妊娠期母羊染病后會(huì)出現(xiàn)流產(chǎn)等不良后果。因此，世界將其列為Ⅰ級(jí)羊群疾病，需引起養(yǎng)殖人員的高度重視。

1 山羊痘病毒的特性

山羊痘病毒作為羊痘病毒屬的一種類型，它的毒素較強(qiáng)，且致死率較高，尤其在羔羊感染中可達(dá)到100%死亡率。山羊痘病毒對(duì)干燥氣候有著突出的耐受力，在羊群結(jié)痂皮膚內(nèi)病毒仍可維持長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月毒性。而在高溫100℃情況下，山羊痘病毒也會(huì)在5min后失活。即使在日常防治過(guò)程中對(duì)其施用500ml/L濃度的酒精或者0.1g/L高錳酸鉀消毒劑，也需要確保消毒時(shí)間超過(guò)1h，否則不能有效消滅病毒。同時(shí)，對(duì)于感染山羊痘病毒的羊群，因其潛伏期最長(zhǎng)可達(dá)到8d，故而無(wú)法起到及時(shí)預(yù)防的作用。通常在感染山羊痘病毒后，會(huì)出現(xiàn)1cm或1.5cm大小的圓狀紅斑，最終形成白色丘疹，對(duì)羊群健康造成極大危害?；诖?，深入研究山羊痘病毒檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的實(shí)踐意義。

2 山羊痘病毒的檢測(cè)方法

2.1 聚合酶檢測(cè)法

聚合酶檢測(cè)法是最為常見(jiàn)的山羊痘檢測(cè)法。相比之下具有較強(qiáng)的檢測(cè)敏感性與特異性。實(shí)際上聚合酶檢測(cè)法是通過(guò)體外酶促合成DNA的方法對(duì)山羊痘病毒加以檢測(cè)。

首先，在應(yīng)用聚合酶檢測(cè)法對(duì)山羊痘病毒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)保持在一個(gè)不存在DNA污染環(huán)境下的專業(yè)PCR實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行操作。

其次，需準(zhǔn)確提取山羊痘病毒DNA，并設(shè)計(jì)引物。一般需保證引物長(zhǎng)度處于15bp到30bp范圍內(nèi)，為了達(dá)到最佳檢測(cè)目的，還需把引物濃度控制在0.00025pM/ml。

最后，還應(yīng)規(guī)范檢測(cè)流程，比如現(xiàn)將山羊痘病毒混合液進(jìn)行離心處置，將其放在PCR檢測(cè)儀器上實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增。具體方法是現(xiàn)將其置于93℃之下約3min或5min，然后再以35次左右循環(huán)次數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)山羊痘病毒實(shí)施40s的93℃、30s的58℃、60s的72℃溫度處理手段，最終在72℃環(huán)境下進(jìn)行7min保溫，從中可得出檢測(cè)結(jié)果。

2.2 反向間接血凝檢測(cè)法

反向間接血凝檢測(cè)法（RPHA）在具體檢測(cè)環(huán)節(jié)應(yīng)按照以下步驟進(jìn)行：

（1）提取病毒，應(yīng)對(duì)山羊痘病毒感染體出現(xiàn)病變細(xì)胞時(shí)進(jìn)行采集，并在病變率達(dá)到75%時(shí)及時(shí)將其收集起來(lái)，當(dāng)成檢測(cè)對(duì)照組樣品。

（2）制備抗原，可在山羊睪丸細(xì)胞上提取40ml山羊痘病毒培養(yǎng)液，并在轉(zhuǎn)速6000r/min、溫度4℃的條件下進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)30min的離心處置。待1d后利用酸堿值為7.2，且濃度為0.01mol/L的無(wú)菌洗脫液（含PBS）對(duì)其加以洗脫，經(jīng)過(guò)紫外光度計(jì)測(cè)器最終可分析出山羊痘病毒中含有的蛋白含量，并以此作為抗原制備基礎(chǔ)。

（3）分離血清，可提取20ml血清，并利用H8N2S水溶液進(jìn)行鹽析，由此在山羊痘活疫苗皮下分離出血清。從相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可知：RPHA法能夠達(dá)到80%左右的檢測(cè)效果，且靈敏度較高。因此，可將其作為一種易于操作的有效檢測(cè)方法。

2.3 雙重聚合酶檢測(cè)法

雙重聚合酶檢測(cè)法相比聚合酶檢測(cè)法經(jīng)濟(jì)性更強(qiáng)，且檢測(cè)效果更好。通常在應(yīng)用雙重聚合酶檢測(cè)法時(shí)具體可從熒光染料法與水解探針?lè)ㄕ归_(kāi)深度研究。其中熒光染料法是將燃料與山羊DNA進(jìn)行雙鏈結(jié)合，并在光源照射下形成熒光信號(hào)，當(dāng)山羊痘病毒擴(kuò)增產(chǎn)物越多時(shí)所形成的熒光反應(yīng)強(qiáng)度就越大，由此得出可靠的病毒檢測(cè)結(jié)果。而在水解探針?lè)ㄖ?，是利用熱穩(wěn)定性DNA聚合酶作為檢測(cè)基礎(chǔ)，由于它具有外切酶活性，針對(duì)DNA序列中核苷酸有著良好的裂解效果。因此，可妥善解決熒光染料法中存在的非特異性問(wèn)題，進(jìn)而達(dá)到最佳檢測(cè)目的。在雙重聚合酶檢測(cè)的檢測(cè)過(guò)程中，若用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，可得出山羊痘病毒檢測(cè)濃度為0.0283ng/ml。

2.4 DNA分子生物檢測(cè)法

山羊痘病毒檢測(cè)是防治山羊痘最重要的部分。以往在山羊發(fā)病時(shí)，會(huì)借助血清學(xué)常規(guī)檢測(cè)法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，但這樣會(huì)遭受抗體交叉風(fēng)險(xiǎn)，從而影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，還有部分地區(qū)利用電鏡觀察法對(duì)山羊痘病毒特性進(jìn)行檢測(cè)，可因其設(shè)備價(jià)格過(guò)于昂貴，導(dǎo)致普及率不高。在此基礎(chǔ)上，DNA分子生物檢測(cè)法是快速檢測(cè)山羊痘病毒特異性與敏感性最有效的方法。它具體是在組織培養(yǎng)液中獲取山羊痘病毒DNA片段，并在酶切分析手段的輔助下實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)檢測(cè)山羊痘病毒，從而為有關(guān)人員研究山羊痘治愈藥物提供重要依據(jù)。同時(shí)，還可利用DNA分子生物檢測(cè)法對(duì)已感染發(fā)病的山羊或已病死的山羊體內(nèi)殘留的山羊痘病毒進(jìn)行檢測(cè)，由此得出在防治山羊痘時(shí)應(yīng)重點(diǎn)弱化其毒性。

3 結(jié)論

綜上所述，我國(guó)對(duì)山羊痘病毒檢測(cè)工作一直予以高度重視。就目前發(fā)展趨勢(shì)來(lái)看，最為主要的檢測(cè)方法包括聚合酶檢測(cè)法、反向間接血凝檢測(cè)法、DNA分析生物檢測(cè)法等。為了取得更大的檢測(cè)成果，應(yīng)在現(xiàn)有基礎(chǔ)上加大研發(fā)力度。