王敬珅，王議鶴，郝志強(qiáng)，楊 恒，汪 淵，李永樂，王勤章，錢 彪

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病之一［1］，該病的成因非常復(fù)雜，納米細(xì)菌（nanobacteria，NB）感染被認(rèn)為是導(dǎo)致結(jié)石形成的主要原因之一［2，3］，其在腎結(jié)石患者的血液、尿液和結(jié)石中的陽性檢出率均在 90%以上［4，5］。 NB 是一種具有超微結(jié)構(gòu)的人體病原菌，具有較強(qiáng)的感染能力，能在菌體外周形成羥磷灰石結(jié)晶外殼，黏附并損害集合管上皮細(xì)胞及腎乳頭細(xì)胞，從而形成結(jié)石［6，7］。

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)石的診斷和治療都有了長足的進(jìn)步，但碎石治療后患者的結(jié)石復(fù)發(fā)率仍然很高［8］。因此，探究泌尿系結(jié)石的形成機(jī)制以尋找新的治療手段是當(dāng)前臨床中亟待解決的難題。四環(huán)素是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，Shoskes等研究了四環(huán)素對NB相關(guān)慢性前列腺結(jié)石患者的治療效果，其中80%患者的癥狀在治療3個月后得到了極大改善，10例患者的結(jié)石縮小50%［9］。然而，目前尚不清楚NB是如何在腎結(jié)石形成的過程中發(fā)揮其獨(dú)特作用的，更遑論治療。

該研究旨在通過NB損傷人腎小管上皮細(xì)胞HK-2導(dǎo)致晶體滯留的機(jī)制研究以及四環(huán)素對這一過程的抑制作用，以期為泌尿系結(jié)石的預(yù)防和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器永生化人腎小管上皮細(xì)胞系HK-2細(xì)胞購自武漢大學(xué)保藏中心。DMEM培養(yǎng)基，1640培養(yǎng)基，胎牛血清，PBS緩沖液 （美國Hyclone公司），一水草酸鈣 （Calcium oxalate monohydrate，COM）， 納米級羥基磷灰石（Nanograde hydroxuapatite，nHAP），四環(huán)素，F(xiàn)ITC-phalloidin（英國Abcam公司）。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱 （美國Thermo公司），掃描儀（日本Canon公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（德國蔡司）。

1.2方法

1.2.1 NB培養(yǎng)與鑒定 于新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科收集臨床確診腎結(jié)石且未應(yīng)用藥物或手術(shù)治療患者的尿液，將無菌條件下獲得的尿液2 ml用生理鹽水稀釋5倍，4℃離心45 min（14 000 g）；取管底 2 ml混勻，以 0.45 μm 濾紙過濾后，再以生理鹽水稀釋5倍，4℃離心45 min（14 000 g）；取管底 1 ml液體充分混勻后，經(jīng) 0.22 μm的濾紙加壓過濾。將濾液1 ml注入含DMEM培養(yǎng)液、10%γ-FBS和1%HEPES緩沖液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，5～7 d換 1次液。倒置相差顯微鏡觀察NB生長，篩選出無污染的標(biāo)本，用吸管吹打均勻后，吸入EP管。12 000 r/min，離心20 min，棄上清液，再加入無菌注射用水1.5 ml吹打混勻。重復(fù)上面步驟共計清洗NB 3次，采用NB鈣染色（Von KOSSA法）和應(yīng)用透射電鏡掃描（負(fù)染法）鑒定。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 選取HK-2細(xì)胞，隨機(jī)分為5組，NB組（NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞），陰性對照組（胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞），陽性對照組（5 mmol/L COM懸液、胎牛血清、1640 培養(yǎng)液+HK-2 細(xì)胞），nHAP 組 （nHAP、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞）和四環(huán)素干擾組（四環(huán)素、NB菌液、胎牛血清、1640培養(yǎng)液+HK-2細(xì)胞）。

1.2.3 各組細(xì)胞透射電子顯微鏡觀察 分別于6 h、12 h、24 h提取各組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，離心后轉(zhuǎn)移至EP管內(nèi)，PBS浸泡10 min后棄上清；加入預(yù)冷的3%戊二醛固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；再加入1%鋨酸固定2 h，PBS洗2次，3 min/次；梯度乙醇脫水，經(jīng) Epon812∶環(huán)氧丙烷=1∶1浸透，包埋后 80℃聚合過夜。行超薄切片、染色。于40透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)與超微結(jié)構(gòu)變化。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡檢測晶體滯留實(shí)驗(yàn) 將HK-2細(xì)胞接種于鋪有清潔蓋玻片的24孔板內(nèi)，共同培養(yǎng)6 h、12 h、24 h后取出各組樣本，加入COM懸液（每孔內(nèi) COM 濃度 200 mg/L），輕搖 5～10 s，使COM晶體與底部細(xì)胞充分接觸。3 min后吸凈蓋玻片上方液體，加入飽和草酸鈉溶液漂洗3次。將蓋玻片從孔板中取出，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，5 min/次，搖床輕晃；加入5 mg/L的phalloidin-FITC 50 μl， 室溫避光孵育 20 min；PBS洗2次，5 min/次；甘油封片。在488 nm和633 nm激發(fā)光下逐一觀察各組玻片并進(jìn)行圖像采集。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法運(yùn)用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件（SPSS Inc.，Chicago，IL）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組細(xì)胞透射電子顯微鏡觀察結(jié)果電鏡結(jié)果見圖1。實(shí)驗(yàn)過程中，空白對照組（圖1A，B，C和D）細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整正常，膜外微絨毛（黑色箭頭）數(shù)量豐富，排列規(guī)則；雙層核膜（黃色箭頭）結(jié)構(gòu)正常，核間隙正常；線粒體（紅色箭頭）形態(tài)正常，未見腫脹或萎縮；細(xì)胞亞顯微結(jié)構(gòu)正常。

實(shí)驗(yàn)開始12 h后，NB組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失（黑色箭頭，圖1E）；細(xì)胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集（黃色箭頭，圖1E）；核外膜局部區(qū)域降解（藍(lán)色箭頭，圖1E）；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹，脊結(jié)構(gòu)模糊不清（紅色箭頭，圖1F）；胞質(zhì)中偶見髓樣小體（圖1F）。nHAP組細(xì)胞膜局部區(qū)域結(jié)構(gòu)破損，微絨毛結(jié)構(gòu)消失（黑色箭頭，圖1M），絨毛結(jié)構(gòu)消失；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹，脊結(jié)構(gòu)模糊不清（紅色箭頭圖1N）。胞質(zhì)中見髓樣小體（綠色箭頭，圖1N）。四環(huán)素組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛結(jié)構(gòu)稍紊亂，局部絨毛消失（圖1Q，黑色箭頭），絨毛結(jié)構(gòu)消失；細(xì)胞核畸形，染色質(zhì)輕度分布不均，局部染色質(zhì)凝集（圖1Q，黃色箭頭）；核外膜局部區(qū)域降解（圖1R，藍(lán)色箭頭）；部分線粒體結(jié)構(gòu)輕度腫脹，脊結(jié)構(gòu)模糊不清（圖1R，紅色箭頭）。胞質(zhì)中偶見髓樣小體（圖1R，綠色箭頭）。COM組細(xì)胞膜局部區(qū)域結(jié)構(gòu)紊亂，微絨毛分布不均，局部區(qū)域絨毛消失（圖1I，黑色箭頭）；細(xì)胞核染色質(zhì)邊集（圖1I，藍(lán)色箭頭）；線粒體結(jié)構(gòu)正常，脊結(jié)構(gòu)清晰。胞質(zhì)中胞質(zhì)中偶見自噬小體。

實(shí)驗(yàn)開始24 h后，NB組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損，胞核裸露在外（粉色箭頭，圖1G）；微絨毛基本消失（黑色箭頭，圖1G），線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹，脊模糊不清（紅色箭頭，圖1H）；胞質(zhì)中可見較多髓樣小體（綠色箭頭，圖1H），胞質(zhì)中自噬小體數(shù)量較多（棕黃色箭頭，圖1H）。nHAP組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，核膜結(jié)構(gòu)正常；微絨毛分布不均，局部區(qū)域絨毛消失（圖1O，黑色箭頭）；細(xì)胞核染色質(zhì)邊集（圖1O，藍(lán)色箭頭）；線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，脊結(jié)構(gòu)模糊不清，局部區(qū)域降解（圖1P，藍(lán)色箭頭）。胞質(zhì)中偶見髓樣小體（圖1P，綠色箭頭）；胞質(zhì)中可見自噬小體（圖1P，棕黃色箭頭）。四環(huán)素組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整，微絨毛基本消失（圖1S，黑色箭頭）；線粒體數(shù)量較少，結(jié)構(gòu)腫脹，脊模糊不清（圖1S，紅色箭頭）。胞質(zhì)中可見較多髓樣小體（圖1T，綠色箭頭）；胞質(zhì)中自噬小體數(shù)量較多（圖1T，棕黃色箭頭）。COM組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破損，微絨毛分布紊亂，絨毛消失；細(xì)胞核膜階段性溶解，核膜結(jié)構(gòu)模糊不清（圖1L，藍(lán)色箭頭）；線粒體結(jié)構(gòu)腫脹，脊模糊不清（圖1L，紅色箭頭）。胞質(zhì)中見髓樣小體（圖 1L，綠色箭頭）及自噬小體（圖 1L，黃色箭頭）。

圖1見封三。

2.2激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示，培養(yǎng)6 h時，NB組、COM組可觀察到少量晶體黏附，隨著共培養(yǎng)時間延長，兩組細(xì)胞晶體黏附量進(jìn)一步增加。共培養(yǎng)6 h和12 h時，nHAP組未觀察到明顯的晶體黏附現(xiàn)象，當(dāng)共培養(yǎng)24 h時，可觀察到少量晶體黏附。各時間點(diǎn)，干擾組中晶體黏附量均顯著少于NB組。

圖2見封三。

3 討論

腎結(jié)石的病因非常復(fù)雜，其涉及遺傳、環(huán)境、生活膳食習(xí)慣等多種因素［10］。以往認(rèn)為腎結(jié)石是由于pH升高而引起磷酸鹽沉積所致，而芬蘭科學(xué)家CIFTCIOGLU團(tuán)隊通過檢測患者的結(jié)石成分，發(fā)現(xiàn)97.2%的腎結(jié)石中含有NB，67%～90%的草酸鈣結(jié)石核心含有類似NB礦化生成的羥磷灰石，從而認(rèn)為NB 是腎結(jié)石礦化的核心［4，11］。 研究證實(shí)，NB 在生長增殖過程中能分泌羥磷灰石類的鈣化物，形成鈣化生物膜，刺激機(jī)體產(chǎn)生以NB為核心的鈣化病變［12，13］。

3.1實(shí)驗(yàn)研究的分組有文獻(xiàn)報道，含鈣結(jié)石占腎結(jié)石的大多數(shù)，且約有23.7%的患者合并尿鈣代謝異常［14］。近年來，大量文獻(xiàn)報道了COM對動物腎小管上皮細(xì)胞的損傷作用。李成文等［15］研究發(fā)現(xiàn)，將5 mmol/L COM晶體加入Wistar大鼠腎小管上皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中8 h后，可以觀察到大量晶體黏附現(xiàn)象發(fā)生。因此，該研究將COM組（5 mmol/L）設(shè)為陽性對照組。NB廣泛存在于人體血液、尿液及組織器官中，可形成磷酸鈣外殼，該外殼成分與nHAP相似。nHAP是一種與人體硬組織的無機(jī)成分相類似的生物活性材料，在替代骨組織方面應(yīng)用潛力較大，但過高濃度的nHAP（200 mg/L以上）會對細(xì)胞DNA及大分子物質(zhì)造成不可逆轉(zhuǎn)的損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［16］。該研究設(shè)置了高濃度nHAP組（300 mg/L）與NB進(jìn)行各項損傷指標(biāo)的比較。同時，筆者設(shè)置干擾組來檢驗(yàn)四環(huán)素的殺菌作用，并將其與NB對HK-2細(xì)胞的損傷進(jìn)行對比。

3.2NB損傷人腎小管上皮細(xì)胞HK-2導(dǎo)致晶體滯留的機(jī)制該研究結(jié)果與既往文獻(xiàn)報道相一致，用透射電子顯微鏡觀察HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化發(fā)現(xiàn)，NB組和nHAP組對HK-2細(xì)胞膜可產(chǎn)生類似的損傷［12］。實(shí)驗(yàn)開始后12 h，兩組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)均完整，線粒體結(jié)構(gòu)出現(xiàn)病變，但NB組細(xì)胞核已經(jīng)出現(xiàn)畸形；實(shí)驗(yàn)開始后24 h，NB組細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)破損，胞核裸露，且胞質(zhì)中可見較多髓樣小體。結(jié)果提示NB組破壞程度比nHAP組嚴(yán)重。既往研究認(rèn)為高濃度的nHAP（>200 mg/L）可導(dǎo)致細(xì)胞大量凋亡或者壞死，該研究中其對HK-2的破壞程度小于NB，提示可能NB的nHAP外殼并不是損傷HK-2的主要物質(zhì)。隨著COM作用時間的推移，胞質(zhì)中線粒體腫脹加重，胞核逐漸溶解消失。NB和nHAP對細(xì)胞的損傷程度也隨著作用時間而加重，但主要表現(xiàn)為刷狀緣排列紊亂，細(xì)胞膜則較完整。通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，nHAP在HK-2細(xì)胞中的分布密度比NB高，但對細(xì)胞的損傷程度卻低于NB。損傷HK-2細(xì)胞后，NB組中細(xì)胞晶體黏附程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于nHAP組。綜合以上結(jié)果表明，NB對HK-2細(xì)胞的損傷程度及晶體滯留的影響遠(yuǎn)大于nHAP，提示在損傷HK-2細(xì)胞及后續(xù)晶體黏附的過程中起主導(dǎo)作用的可能并非NB的磷酸鈣外殼，而是其菌體本身。

3.3四環(huán)素的抑菌作用得益于礦化生物被膜的保護(hù)，NB不僅能夠耐高溫，脫水、冰凍、紫外線及γ輻射，青霉素、頭孢菌素及大環(huán)內(nèi)酯等普通抗生素也對其無效［7，17，13］。 殺滅 NB 的藥物有氨芐西林、甲氧芐啶和強(qiáng)力毒素等，但是其對人體產(chǎn)生毒害甚至致死劑量時才發(fā)揮藥效，因此不能應(yīng)用于臨床［18］。四環(huán)素是為數(shù)不多的能在生理濃度下殺滅NB的抗菌藥物之一，它可以穿透NB的鈣質(zhì)外殼，同時抑制其鈣化，從而發(fā)揮抗菌作用。有文獻(xiàn)報道，四環(huán)素在治療 NB 相關(guān)的慢性前列腺炎［9，19］、間質(zhì)性膀胱炎［20］等方面均取得了不錯的效果。Zhou［9］為探討納米桿菌感染與Ⅲ型前列腺炎的關(guān)系，選取48例慢性盆腔疼痛綜合征患者，隨機(jī)分為兩組，一組接受四環(huán)素抗NB治療，另一組接受安慰劑治療。在治療前后，分別從患者的前列腺液和尿液中分離培養(yǎng)NB，記錄其形態(tài)學(xué)特征，檢測16SrRNA基因的表達(dá)，用國家衛(wèi)生研究院的NB陽性率和癥狀變化評價療效。經(jīng)抗NB治療后，前列腺液中NB陽性率由62.5%下降到16.7%，前列腺按摩后尿標(biāo)本則從12.5%下降到0%，而安慰劑組無明顯變化。結(jié)果顯示治療前后慢性疼痛綜合征患者的16SrRNA基因序列并無差別，而治療后慢性前列腺炎癥狀指數(shù)評分明顯下降，而安慰劑治療后慢性前列腺炎癥狀指數(shù)評分無明顯變化。可以認(rèn)為，四環(huán)素是抗NB治療的有效方法。該研究在損傷HK-2細(xì)胞后，電鏡顯示NB組中細(xì)胞晶體黏附程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于四環(huán)素干擾組；提示四環(huán)素可以抑制NB對HK-2細(xì)胞的損傷并減少損傷后的晶體滯留，這一結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了四環(huán)素在腎結(jié)石的預(yù)防和治療方面的有效性，對于該病在臨床上的診治具有積極的意義。

綜上所述，NB可損傷HK-2細(xì)胞，損傷程度和晶體滯留程度與NB作用時間成正比，四環(huán)素可以抑制這一過程。因此，NB可能通過以下途徑導(dǎo)致腎結(jié)石的形成：NB感染損傷腎小管上皮細(xì)胞后，晶體向暴露的基底膜黏附，與NB和壞死細(xì)胞碎片共同形成結(jié)石。因此運(yùn)用四環(huán)素或其他抗菌藥物滅殺NB可能是預(yù)防和治療結(jié)石的一個新的方向。