陳碧華,郭衛(wèi)麗,孟凡茹,周俊國,李新崢,申可
(1.河南科技學(xué)院園藝園林學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003; 2.新鄉(xiāng)市牧野區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,河南新鄉(xiāng)453003)
【研究意義】土壤鎘(Cd)污染目前已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)面源污染熱點(diǎn)問題之一,Cd 主要來源于汽車尾氣、工業(yè)排放、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥及化肥殘留等[1-2]。徐笠等[3]研究顯示設(shè)施蔬菜基地土壤中重金屬遷移能力最強(qiáng)和危害系數(shù)最大的是Cd。大棚菜田土壤中Cd 已構(gòu)成了嚴(yán)重污染[4]。當(dāng)Cd 進(jìn)入植物的組織、細(xì)胞中,會(huì)干擾細(xì)胞的正常生理代謝[5],破壞植物葉綠素與蒸騰作用[6],導(dǎo)致生長(zhǎng)紊亂甚至死亡。當(dāng)Cd 超過一定質(zhì)量濃度后,會(huì)影響蔬菜的食用安全[7]?!狙芯窟M(jìn)展】Cd 在植物體內(nèi)的分布趨勢(shì)為根>莖>葉>籽實(shí),根對(duì)Cd的累積占總量的70%~80%,籽實(shí)只占1%~10%,但是煙草及某些蔬菜如胡蘿卜葉片含Cd 量高于根部[8]。Cd 在植株中亞細(xì)胞分布順序?yàn)椋杭?xì)胞壁>可溶部分>細(xì)胞核[9-10]。Cd 在花椰菜葉片中亞細(xì)胞分布順序?yàn)椋杭?xì)胞質(zhì)>細(xì)胞壁>葉綠體和線粒體[7]。可見Cd 集中分布在細(xì)胞壁和細(xì)胞質(zhì)中就可能避免重金屬損害植物功能性相對(duì)重要的組織如細(xì)胞器,這正是重金屬植物能解毒的原因[8]。植物細(xì)胞壁的固定和細(xì)胞液的區(qū)間隔化作用能使重金屬在植物體內(nèi)積累,而蛋白質(zhì)和多肽等物質(zhì)也能與重金屬結(jié)合,也使重金屬滯留植物體內(nèi)[11]。所以研究重金屬元素在植物體內(nèi)的亞細(xì)胞分布,有助于解釋植物對(duì)重金屬富集和解毒機(jī)制[9]。
【切入點(diǎn)】目前設(shè)施蔬菜主要是通過嫁接克服連作障礙問題[12-15]。大棚黃瓜栽培中常用的嫁接砧木是南瓜,可有效地防止土傳病害的發(fā)生,而針對(duì)南瓜的耐鎘性研究少見報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在研究鎘脅迫下南瓜植株中鎘的積累、轉(zhuǎn)運(yùn)、亞細(xì)胞分布以及光合特性分析,進(jìn)一步揭示南瓜對(duì)重金屬鎘的富集特征和毒性機(jī)理,為大棚黃瓜耐鎘砧木的篩選提供科學(xué)依據(jù)。
供試材料為大棚黃瓜嫁接砧木‘鹽砧一號(hào)’(由河南科技學(xué)院南瓜課題組提供)。試驗(yàn)時(shí)間為2018年9月,試驗(yàn)地點(diǎn)為河南科技學(xué)院園藝植物栽培實(shí)驗(yàn)室。試驗(yàn)采用基質(zhì)栽培,基質(zhì)按草炭、蛭石、珍珠巖質(zhì)量比為3∶1∶1的比例配置,加三元復(fù)合肥 1kg/m3,多菌靈0.2kg/m3對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒,使基質(zhì)含水率達(dá)到70%,基質(zhì)中含鎘量為0 mg/L。
試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理,分別加不同量的Cd(以CdSO4的形式加入):0(對(duì)照)、2、4、6 mg/L,每個(gè)處理設(shè)置4次重復(fù),每個(gè)塑料小黑方(7cm 口徑)裝配好基質(zhì)0.00027m3。將催過芽的南瓜種子播種于基質(zhì)中,覆膜保溫保濕。在種子出苗2 片子葉展平并露出真葉時(shí),添加不同質(zhì)量濃度Cd 進(jìn)行脅迫處理,分別用移液槍澆到植株根系附近10mL,每5 天處理1次,共處理4次,植株長(zhǎng)至4 片葉收獲。將南瓜植株分為根系、莖、葉片分別洗凈、晾干。為了除掉南瓜根系表面吸附的Cd,將南瓜根系先用純水沖洗干凈,再用20mmol/LNa2-EDTA 交換處理20min,然后用去離子水清洗干凈,并吸干表面水分。植物鮮樣置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩T囼?yàn)用水均為超純水。
1.2.1 南瓜植株中Cd 質(zhì)量濃度的測(cè)定
采用微波消解-ICP-AES 技術(shù)測(cè)定,將南瓜植株的根系、莖、葉片干樣分別剪碎,稱取0.2g 烘干樣品于聚四氟乙烯消解罐中,依次加入硝酸8 mL、高氯酸2 mL,混合均勻加密封蓋后至于MAS 微波消解儀(美國CEM 公司)內(nèi),設(shè)置最佳微波消解程序進(jìn)行消解。消解結(jié)束后消解液為無色澄清透明,無沉淀,樣品消解完全。待消解罐冷卻后,把消解液用0.2%的稀HNO3轉(zhuǎn)移到50 mL 聚四氟乙烯燒杯中,置于電熱板170℃趕酸至近干。以除去多余的氮氧化物,加入2 mL 0.2% HNO3溶解殘?jiān)?,最后轉(zhuǎn)移到25 mL 容量瓶中(GG-17 玻璃),定容搖勻后轉(zhuǎn)移到聚乙烯塑料瓶中,用Optima 2100 DV 電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(美國Perkin Elmer 公司)測(cè)定重金屬Cd 全量。試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值。
1.2.2 南瓜植株中亞細(xì)胞組分分離與分析
按照侯明等[16]的方法,分別稱取南瓜植株根系、莖、葉片等鮮樣2.0g,分別加入20mL 提取液[0.25 mmol/L 蔗糖、50 mmol/LTric-Hcl 緩沖液(pH7.5)和1 mmol/L 二硫代蘇糖醇],在冰浴中用瑪瑙研缽研磨成勻漿,勻漿液放置在超速冷凍離心機(jī)中,將離心機(jī)溫度設(shè)定為4℃,600 轉(zhuǎn)速下離心10min,下層沉淀碎片為細(xì)胞壁以及未破碎殘?jiān)?。移取上層懸浮液放?℃超速冷凍離心機(jī)中,1000 轉(zhuǎn)速下離心15min,沉淀為細(xì)胞核,上清液在10000 轉(zhuǎn)速下離心20 min,沉淀為細(xì)胞器(線粒體和葉綠體);上清液為細(xì)胞質(zhì)(核蛋白和可溶性組分)。采用ICP-AES 技術(shù)測(cè)定各組分Cd 質(zhì)量濃度。
1.2.3 Cd 脅迫下南瓜植株葉片光合特性
使用LI-6400 型便攜式光合儀進(jìn)行測(cè)定。選擇晴朗無風(fēng)天氣,于上午09:00-10:00 測(cè)定葉片氣體交換參數(shù)。每小區(qū)選取3株生長(zhǎng)均勻健康的植株,每株選取自頂端向下的葉片,重復(fù)3次,取平均值。設(shè)定光合有效輻射為1000μmol/(m2?s),使用開放式氣路,空氣流速為500μmol/s,測(cè)定南瓜的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2量。
轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(Translocation factor,TF)是指植物地上部與根部重金屬量的比值,用來表示植物體對(duì)重金屬從根部到地上部的有效轉(zhuǎn)移程度[17],計(jì)算公式參照Tanhan et.al的方法[18]:TF=地上部Cd 質(zhì)量濃度(μg/g)/地下部Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g)。根系對(duì)重金屬的富集系數(shù)(Bioconcentration factor,BCF)=根部Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g)/土壤中Cd 質(zhì)量分?jǐn)?shù)(μg/g)[19]。試驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用SPSS 和Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。采用Duncan 多重比較法對(duì)顯著性差異(p<0.05)進(jìn)行多重比較。
南瓜植株不同器官中Cd 質(zhì)量濃度見表1。由表1可知,當(dāng)Cd 質(zhì)量濃度從2 mg/L 增加到6 mg/L,Cd在南瓜植株根中質(zhì)量濃度增加幅度遠(yuǎn)大于莖和葉,從1.86mg/kg 增加到5.95 mg/kg,與對(duì)照相比存在顯著差異(p<0.05)。Cd 在莖和葉中的質(zhì)量濃度隨著Cd處理質(zhì)量濃度的增加逐漸增加,莖和葉中富集的Cd較少;Cd 脅迫質(zhì)量濃度愈高,南瓜植株根部積累的Cd 就愈多。
表1 南瓜植株不同器官中Cd 質(zhì)量濃度Table1 Cd mass concentration in different organs of pumpkin
隨著Cd 脅迫質(zhì)量濃度增大,根富集系數(shù)BCF值呈上升趨勢(shì)。當(dāng)Cd 脅迫質(zhì)量濃度達(dá)6mg/L,南瓜植株中Cd的BCF值最大為0.99。說明隨著Cd 質(zhì)量濃度增大,南瓜植株富集Cd的能力增強(qiáng),也就是說當(dāng)環(huán)境中Cd 質(zhì)量濃度越高,向南瓜植株根部遷移的能力越強(qiáng),使根部吸收富集能力增強(qiáng),從而導(dǎo)致在高質(zhì)量濃度Cd 脅迫下南瓜植株的富集系數(shù)BCF較高。隨著鎘脅迫質(zhì)量濃度的增大,轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)TF值從2 mg/L的1.05 逐漸降低到6mg/L的0.84,表明隨著Cd 脅迫質(zhì)量濃度的增大南瓜植株把Cd 從根部轉(zhuǎn)移到莖和葉的能力逐漸減弱。
圖1 南瓜植株根莖葉中Cd所占比例Fig.1 Proportion of Cd in roots,stems and leaves of pumpkin
根據(jù)Cd 在南瓜植株不同器官中的質(zhì)量濃度,計(jì)算出Cd 在南瓜植株各器官中所占比例,如圖1所示。由圖1可知,隨著Cd 脅迫濃度的升高,Cd 在南瓜根系中的質(zhì)量濃度顯著升高,在莖和葉中的質(zhì)量濃度隨著Cd 脅迫質(zhì)量濃度的增加而下降,表明南瓜植株吸收的Cd 大部分積累在根部,轉(zhuǎn)移到莖和葉中的較少,這有利于減輕土壤Cd 對(duì)植株特別是葉片的毒害效應(yīng)。Cd在南瓜植株不同器官中的質(zhì)量濃度分布為根>莖>葉。
表2為各處理南瓜植株不同器官亞細(xì)胞Cd質(zhì)量濃度。由表2可知,Cd在不同器官的亞細(xì)胞分布呈不均勻狀態(tài),其中根系中以細(xì)胞壁中質(zhì)量濃度最高,占總量的47.63%~57.69%;其次為細(xì)胞質(zhì);細(xì)胞器中的Cd質(zhì)量濃度最少,僅占1.93%~4.59%。Cd脅迫質(zhì)量濃度增加,葉片中Cd質(zhì)量濃度和各亞細(xì)胞的Cd質(zhì)量濃度顯著增加,其中,葉片Cd質(zhì)量濃度比低質(zhì)量濃度增加了1.19倍,細(xì)胞壁Cd質(zhì)量濃度增加了1.31倍,細(xì)胞質(zhì)Cd質(zhì)量濃度增加了1.43倍,細(xì)胞器Cd僅增加0.25倍。說明隨著Cd脅迫質(zhì)量濃度提高,表現(xiàn)為Cd向細(xì)胞壁積累增加,而向其余組分積累相對(duì)減少。
表2 不同Cd脅迫南瓜植株不同器官亞細(xì)胞中Cd質(zhì)量濃度及分配率Table2 Cd mass concentration and percent distributions of different concentrations of Cd in subcellular fractions of pumpkin
表3 南瓜葉片中總Cd質(zhì)量濃度與各亞細(xì)胞組分之間的相關(guān)性Table3 Correlation analysis between the mass concentration of total Cd in pumpkin leaves and subcellular fractions
表3為葉片中總Cd 質(zhì)量濃度與各亞細(xì)胞組分Cd質(zhì)量濃度間的相關(guān)分析。由表3可以看出,在0~6mg/LCd 處理范圍內(nèi),南瓜葉片總Cd 質(zhì)量濃度與細(xì)胞壁Cd 質(zhì)量濃度極顯著正相關(guān),與細(xì)胞質(zhì)Cd 質(zhì)量濃度顯著正相關(guān),與細(xì)胞器Cd 質(zhì)量濃度、細(xì)胞核Cd質(zhì)量濃度呈正相關(guān),但相關(guān)性不顯著;細(xì)胞壁Cd 質(zhì)量濃度與細(xì)胞質(zhì)Cd 質(zhì)量濃度之間存在顯著正相關(guān),與細(xì)胞器、細(xì)胞核Cd 質(zhì)量濃度之間呈正相關(guān),但相關(guān)性不顯著;細(xì)胞質(zhì)Cd 質(zhì)量濃度與細(xì)胞器、細(xì)胞核Cd 質(zhì)量濃度之間呈正相關(guān),但相關(guān)性不顯著;細(xì)胞器Cd 質(zhì)量濃度與細(xì)胞核Cd 質(zhì)量濃度之間呈正相關(guān),但相關(guān)性不顯著。
南瓜植株光合指標(biāo)見表4。由表4可知,Cd脅迫沒有對(duì)南瓜植株凈光合速率(Pn)造成顯著抑制作用。2 mg/L處理抑制了氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr),限制了光合作用的過程,但是由于處理時(shí)間比較短,并未影響凈光合速率,4 mg/L和6 mg/L處理葉片氣孔導(dǎo)度分別降為0 mg/L處理的64.20%和39.51%,而蒸騰速率降為0 mg/L處理的60.25%和45.34%,差異顯著;但各處理胞間CO2摩爾分?jǐn)?shù)(Ci)未見顯著差異。
表4 不同Cd 脅迫下南瓜植株光合指標(biāo)Table4 Effects of different mass concentration Cd stress on pumpkin photosynthesis
Cd 在南瓜植株不同器官的分布表明,Cd 在南瓜植株根中質(zhì)量濃度遠(yuǎn)大于莖和葉,而Cd 在南瓜莖和葉片中的質(zhì)量濃度隨著Cd 脅迫質(zhì)量濃度的增加逐漸增加,南瓜莖和葉中Cd 富集較少;這在辣椒[20]、生菜[21]等蔬菜早已得到證實(shí)。當(dāng)環(huán)境中Cd 脅迫質(zhì)量濃度愈高,南瓜植株根部積累的Cd 就愈多。根富集系數(shù)BCF值呈上升趨勢(shì),當(dāng)環(huán)境中Cd 質(zhì)量濃度越高,向南瓜植株根部遷移的能力越強(qiáng)。轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)TF值逐漸降低,表明隨著Cd 脅迫質(zhì)量濃度的增大南瓜植株把Cd 從根部轉(zhuǎn)移到莖和葉的能力逐漸減弱。這為解釋Cd 在南瓜植株葉片中質(zhì)量濃度較低提供了有力證據(jù)。
相關(guān)分析顯示,葉片細(xì)胞壁Cd 質(zhì)量濃度與葉片總Cd 質(zhì)量濃度之間呈顯著正相關(guān)關(guān)系,說明根吸收的Cd 向上運(yùn)輸至葉片細(xì)胞壁中累積。其中2 mg/L 處理顯著抑制了氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr),從而影響到光合作用,但由于Cd 脅迫時(shí)間較短,未能影響凈光合速率,4 mg/L 和6 mg/L 處理葉片氣孔導(dǎo)度(Gs)和蒸騰速率(Tr)顯著下降。從亞細(xì)胞水平分析,Cd 脅迫沒有導(dǎo)致南瓜的光合作用降低,是因?yàn)镃d 在細(xì)胞壁中大量累積造成的。植物對(duì)Cd 脅迫有一定的適應(yīng)機(jī)制,可能通過調(diào)整Cd 在亞細(xì)胞組分中的分配實(shí)現(xiàn)[23]。細(xì)胞壁中Cd 質(zhì)量濃度占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),而細(xì)胞器和細(xì)胞核中Cd 質(zhì)量濃度最低,Cd 脅迫質(zhì)量濃度增加,Cd 在細(xì)胞壁中增加幅度大于細(xì)胞質(zhì)。
1)Cd 在南瓜植株中的富集特征表現(xiàn)為:根中Cd質(zhì)量濃度遠(yuǎn)大于莖和葉并且隨著Cd 脅迫增強(qiáng),根富集系數(shù)BCF值呈上升趨勢(shì),轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)TF值逐漸降低。
2)根系中亞細(xì)胞分布特征為:細(xì)胞壁中Cd 質(zhì)量濃度占總量的47.63%~57.69%;其次為細(xì)胞質(zhì);細(xì)胞器中僅占1.93%~4.59%。
3)Cd 脅迫沒有對(duì)南瓜植株凈光合速率(Pn)造成顯著抑制作用。