丁嘉寧，梁利寶，馮鵬艷，許劍敏

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山西太谷 030801）

0 引言

【研究意義】山西省是全國重要的煤炭大省之一，同時也是采煤毀地的“重災(zāi)區(qū)”，全省因采煤造成的采空區(qū)面積近5000 km2，其中沉陷區(qū)面積約3000 km2，而且煤礦采空區(qū)仍以每年80 km2以上的速度擴(kuò)大，大量耕地遭到嚴(yán)重破壞。主要因?yàn)樗輩^(qū)面積大，該區(qū)復(fù)墾對于提高土地資源利用率，促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展有一定的幫助。但是復(fù)墾土壤是一種重構(gòu)土壤，塌陷區(qū)的填土的來源主要是周邊丘陵區(qū)黃土，土壤類型和質(zhì)地與塌陷區(qū)相同，其土壤粒徑大、養(yǎng)分低、生物活性差，加之在“混推”過程中大型機(jī)械設(shè)備對土壤的碾壓，土壤生產(chǎn)力極其低下，因此，施肥成為加速復(fù)墾土壤熟化的一種可行性手段。

【研究進(jìn)展】多數(shù)學(xué)者認(rèn)為施肥可以改善土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)土壤質(zhì)量和結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力養(yǎng)分和酶活性，增強(qiáng)土壤微生物活性。蘇慧清等[1]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥處理顯著增加了土壤中＞1mm 棕壤的團(tuán)聚體量，無機(jī)肥處理顯著提高了黏粉粒（＜0.053 mm 團(tuán)聚體）的量，降低大團(tuán)聚體（＞2 mm）與微團(tuán)聚體（0.053～0.25 mm）量；Chaudhary 等[2]則認(rèn)為無機(jī)肥的施加對土壤體積質(zhì)量、土壤團(tuán)聚性并不會產(chǎn)生負(fù)面影響。適當(dāng)增加有機(jī)肥可以降低體積質(zhì)量、增加大團(tuán)聚體數(shù)量，改善土壤質(zhì)量[3]。Bei 等[4]研究表明有機(jī)肥替代無機(jī)肥短期內(nèi)顯著提高土壤堿解氮、速效鉀，也會顯著增加全氮、有機(jī)質(zhì)；但是，無機(jī)肥對全氮和有機(jī)質(zhì)影響不明顯。梁路等[5]研究得出黃土高原旱地麥田有機(jī)肥（30 t/hm2）配施無機(jī)氮（150kg/hm2）土壤有機(jī)質(zhì)、養(yǎng)分和蔗糖酶、堿性磷酸酶和脲酶活性，要高于施氮量225、300 kg/hm2處理，這對實(shí)現(xiàn)我國2020年化肥用量零增長目標(biāo)具有重要意義。大量研究結(jié)果表明不同施肥處理對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響也存在差異。Wang 等[6]研究表明有機(jī)肥處理的土壤細(xì)菌豐度明顯高于無機(jī)肥處理，無機(jī)肥處理主要增加了擬桿菌門、酸桿菌門的豐度，有機(jī)肥則對大多數(shù)優(yōu)勢細(xì)菌都有促進(jìn)作用。但Shi 等[7]研究發(fā)現(xiàn)無機(jī)磷的施入對于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響不顯著。賈俊香等[8]研究表明施用生物炭明顯提高了采煤塌陷復(fù)墾養(yǎng)分、酶活性，何冰等[9]研究表明單施有機(jī)肥可提高不同復(fù)墾年限土壤團(tuán)聚體有機(jī)碳氮量及團(tuán)聚體穩(wěn)定性，復(fù)墾4、8a的土壤1～2 mm 團(tuán)聚體比例最高，達(dá)到25%～31%。劉京等[10]研究施用有機(jī)肥降低了土壤＜0.01 mm 團(tuán)聚體比例，增加了＞0.25 mm 團(tuán)聚體比例。土壤團(tuán)聚體的平均粒徑團(tuán)聚度越高，穩(wěn)定性就越強(qiáng)，土壤肥力越高[11]。孟會生等[12]發(fā)現(xiàn)磷細(xì)菌肥提高了采煤塌陷區(qū)復(fù)墾土壤放線菌數(shù)量，且改變了放線菌群落結(jié)構(gòu)組成。而關(guān)于不同施肥措施對采煤塌陷復(fù)墾土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的研究較少。

【切入點(diǎn)】綜上所述，在不同環(huán)境條件下，施肥對不同類型土壤培肥效果存在差異，不同施肥方式對采煤塌陷復(fù)墾土壤的物理、化學(xué)以及對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響如何，差異是否明顯有待深入研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于此，以晉東南地區(qū)采煤塌陷復(fù)墾2a土壤為對象，研究不同施肥處理對土壤理化性狀以及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響并探討其機(jī)理，旨在為加速復(fù)墾土壤熟化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地點(diǎn)選在山西省晉城市北石店鎮(zhèn)采煤塌陷復(fù)墾區(qū)，該地區(qū)屬暖溫帶半溫潤大陸性季風(fēng)氣候，年平均氣溫5～10℃ ,年平均降水量550～650mm，無霜期150～170d。供試土壤基本理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table1 Basic physicochemical properties of tested soil

1.2 試驗(yàn)材料

供試玉米品種為澤玉41號，生育期為140 d 左右。供試化肥為尿素（N 46%）和過磷酸鈣（P2O512%）、硫酸鉀（K2O 43%）；供試有機(jī)肥使用腐熟雞糞,有機(jī)質(zhì)量為175.44g/kg，N 量為1.36%，P2O5量為0.95%，K2O 量為1.23%，含水率為30.6%，pH值為8.04。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)時間為2019年5—9月，共設(shè)置4個處理，分別是有機(jī)肥處理（M），無機(jī)肥處理（W），50%有機(jī)肥+50%無機(jī)肥處理（WM）和不施肥處理（CK），采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個小區(qū)面積20m2（4m×5m），每個處理重復(fù)3次。每個施肥處理施入等量的氮、磷、鉀，N、P2O5、K2O 施入量分別為120、60 和98kg/hm2，單施有機(jī)肥處理養(yǎng)分不足，則用少量化肥補(bǔ)齊，對照不施肥。播種前所有肥料均一次性施入土壤，玉米在2019年5月2日播種，9月18日收獲。玉米收獲后采集0～20cm 土壤樣品進(jìn)行測定。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 土壤樣品采集和前處理

土壤樣品采集后取出石塊、根系等雜物，過2mm篩后混合均勻，分成2 份，將其中1 份樣品放置于無菌袋中-80℃保存用以土壤微生物DNA 提?。涣?份樣品則風(fēng)干后，按照四分法，研磨、過篩，進(jìn)行其他理化指標(biāo)的測定。

1.4.2 土壤理化指標(biāo)測定

土壤pH值采用酸度計(jì)測定（水土比5∶1）[13]；土壤體積質(zhì)量采用環(huán)刀法測定[13]；土壤團(tuán)聚體的測定采用干篩法[14]；土壤有機(jī)質(zhì)采用油浴加熱法測定[15]；土壤全氮采用開氏蒸氮法測定[15]；土壤堿解氮采用堿解擴(kuò)散法測定[15]；土壤全磷采用鉬銻抗比色法測定[15]；土壤速效磷采用0.5mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定[15]；土壤速效鉀采用火焰燃燒法測定[15]；轉(zhuǎn)化酶采用3,5-二硝基水楊酸比色法[16]；過氧化氫酶采用高錳酸鉀滴定法[16]；脲酶采用靛酚藍(lán)比色法[16]；磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法[16]。

1.4.3 高通量測序方法

土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)采用高通量測序（IlluminaMi seq PE300 測序平臺）的方法測定。對16S rRNA 基因的V3-V4 高變區(qū)片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和8 06R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）[17]。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性3 min，接著進(jìn)行29個循環(huán)，包括95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45s；循環(huán)結(jié)束后72℃最終延伸10min，保持10℃直到停止。使用Trimmomatic 軟件原始測序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH 軟件進(jìn)行拼接；得到的序列用UPARSE 軟件進(jìn)行處理根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU 聚類，利用RDP classififier軟件平臺對OTU進(jìn)行物種分類，從而獲得每個OTU的分類學(xué)信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Canoco5.0 軟件對復(fù)墾土壤細(xì)菌與化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行冗余分析（RDA），數(shù)據(jù)處理采用IBMSPSSSta tistics 21 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥處理對土壤團(tuán)聚體組成特征的影響

從表2可以看出，與CK相比，施肥對復(fù)墾土壤的體積質(zhì)量影響不顯著。與CK相比，M處理顯著（p＜0.05）增加了＞2mm 大團(tuán)聚體、1～2mm 較大團(tuán)聚體比例，WM處理顯著（p＜0.05）增加了1～2、0.25～1mm 較大團(tuán)聚體比例，同時M、WM處理也都顯著（p＜0.05）降低了0.053～0.25mm、＜0.053mm小團(tuán)聚體比例，其中M、WM處理效果顯著，W 處理的作用一般。對不同粒級的團(tuán)聚體而言，無機(jī)肥表現(xiàn)出與有機(jī)肥較為相似的規(guī)律，但作用不如有機(jī)肥明顯。

表2 不同施肥處理復(fù)墾土壤體積質(zhì)量及團(tuán)聚體組成Table2 Volume and mass of reclaimed soil and aggregate composition under different fertilization treatments

2.2 不同施肥處理對復(fù)墾土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分的影響

從表3看出，施肥后復(fù)墾土壤的pH值未發(fā)生顯著變化。各施肥處理土壤有機(jī)質(zhì)較 CK 提高了6.03%～12.02%，且M處理效果顯著（p＜0.05）強(qiáng)于W 處理；各施肥處理土壤全氮、全磷量分別較CK 增加了8.33%～20%、13.63%～25%，堿解氮、速效磷、速效鉀量則分別較 CK 增加了 11.96%～29.7%、7.03%～12.81%、6.66%～20.12%，施肥對土壤堿解氮效果最明顯，速效鉀次之，速效磷影響效果最小。對于全氮、全磷而言，M處理促進(jìn)效果強(qiáng)于W 處理，對于速效養(yǎng)分而言，則正好相反。說明M處理的全氮、全磷較W 處理養(yǎng)分釋放慢，因此前者的全氮、全磷量要高于后者，WM處理的作用基本是介于M、W 處理之間，但該處理與其余處理差異不顯著。

表3 不同施肥處理復(fù)墾土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分Table3 Soil organic matter and nutrients were reclaimed by different fertilization treatments

2.3 不同施肥處理對復(fù)墾土壤酶活性的影響

從表4可以看出，不同施肥對復(fù)墾土壤酶活性均有不同程度的提高，過氧化氫酶、磷酸酶、脲酶和轉(zhuǎn)化 酶的較CK分別增加了1.14%～5.26%、3.17%～20.62%、9.57%～14.95%、2.34%～9.67%，說明施肥對土壤磷酸酶和脲酶活性效果最明顯，過氧化氫酶、轉(zhuǎn)化酶效果影響較為一般，其中M處理顯著（p＜0.05）提高了磷酸酶、轉(zhuǎn)化酶活性，W 處理顯著（p＜0.05）提高了脲酶活性。

表4 不同施肥處理復(fù)墾土壤酶活性Table4 Enzyme activity of reclaimed soil under different fertilization treatments

2.4 不同施肥處理對復(fù)墾土壤細(xì)菌多樣性的影響

從圖1得出（圖中橫坐標(biāo)為主要細(xì)菌群落的英文名稱取前3個字母的縮寫形式，Oth 代表其他細(xì)菌群落。），從門水平來看，不同處理復(fù)墾土壤主要細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成是相同的，按照豐度主要為：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、螺旋體菌門（Saccharibacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）。變形菌門是土壤中豐度最高的優(yōu)勢菌，施肥后各處理的豐度增加了4.47%～18.34%，M、WM處理顯著（p＜0.05）高于CK，M、W 處理土壤放線菌門豐度顯著（p＜0.05）高于 CK，且顯著（p＜0.05）降低了酸桿菌門（Acidobacteria）。M、WM處理顯著（p＜0.05）降低了綠彎菌門的豐度。結(jié)果表明不同施肥處理中，M處理對復(fù)墾土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響最顯著。

圖1 不同施肥處理復(fù)墾土壤細(xì)菌門水平群落結(jié)構(gòu)組成Fig.1 Community structure of bacteriophyta in reclaimed soil under different fertilization treatments

2.5 土壤養(yǎng)分與復(fù)墾土壤細(xì)菌多樣性的相關(guān)性

不同施肥處理復(fù)墾土壤細(xì)菌群落多樣性與土壤理化因子進(jìn)行冗余排序分析（RDA）如圖2所示。

圖2 不同施肥處理下復(fù)墾土壤細(xì)菌群落與 土壤理化因子的冗余分析（RDA）Fig.2 Redundancy analysis of soil bacterial community and soil physical and chemical factors in reclaimed soil under different fertilization treatments（RDA）

RDA 圖的第一排序軸和第二排序軸分別解釋了57.98%和23.34%，累計(jì)解釋量達(dá)81.32%，說明前2軸能較好地反映土壤細(xì)菌菌門豐度與土壤理化因子的關(guān)系。細(xì)菌門水平上，各處理在RDA 圖上分布存在顯著差異，CK 明顯與其他處理分布位置不同，表明施肥后均會改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，M處理與CK的距離更大，說明M處理對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響更大。在8個土壤理化因子中，土壤體積質(zhì)量（r=0.084）和pH值（r=0.268）與第一軸成正相關(guān)，有機(jī)質(zhì) （r=-0.788）與第一軸呈最大負(fù)相關(guān)，其次是速效磷（r=-0.767），全磷（r=-0.598），速效鉀（r=-0.530），堿解氮（r=-0.498）和全氮（r=-0.489）。

全磷（F=4.7，p=0.002），有機(jī)質(zhì)（F=5.3，p=0.004），堿解氮（F=5.8，p=0.004）和體積質(zhì)量（F=4.1，p=0.008）是造成土壤細(xì)菌群落豐度差異的主要原因，土壤pH值的RDA 分析顯示p=0.942＞0.05，對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。CK 在體積質(zhì)量上的投影在正方向，而M處理和W 處理分布在體積質(zhì)量的負(fù)方向，表明施用有機(jī)肥或者無機(jī)肥通過降低土壤體積質(zhì)量與CK形成差異。CK 在有機(jī)質(zhì)、速效磷、全磷、速效鉀、堿解氮和全氮上的投影在負(fù)方向，施肥處理的投影分布在正方向，表明施肥提高了土壤理化因子從而與CK 產(chǎn)生差異。根據(jù)樣本與理化因子垂直交點(diǎn)到箭頭的距離可知體積質(zhì)量對不同施肥處理土壤細(xì)菌群落豐度的影響大小排序：WM處理＞CK＞M處理＞W(wǎng)處理，而有機(jī)質(zhì)、速效磷、全磷、速效鉀、堿解氮和全氮對不同施肥處理土壤細(xì)菌群落豐度的影響大小排序?yàn)椋篗處理＞W(wǎng) 處理＞W(wǎng)M處理＞CK。

3 討論

3.1 不同施肥處理對復(fù)墾土壤團(tuán)聚體組成的影響

團(tuán)聚體是土壤結(jié)構(gòu)的基本單位,其粒級大小、含量直接反應(yīng)土壤結(jié)構(gòu)性的優(yōu)劣，并成為土壤質(zhì)量高低的主要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)（表2），1～2mm 團(tuán)聚體是土壤的優(yōu)勢粒級，M、WM處理0.053～0.25mm、＜0.053mm的團(tuán)聚體量較CK 顯著降低，而1～2mm 團(tuán)聚體增幅明顯，可以推出施肥促進(jìn)了二者間的轉(zhuǎn)換，即小團(tuán)聚體結(jié)合形成了大團(tuán)聚體，但不能排除其他粒級的團(tuán)聚體沒有參與這樣的轉(zhuǎn)換。分析原因是有機(jī)質(zhì)是土壤團(tuán)聚體形成的主要膠結(jié)劑[18]，很大程度上影響了土壤中團(tuán)聚體的數(shù)量以及穩(wěn)定性。CK 由于土壤養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)缺乏，微生物生長受到抑制，導(dǎo)致了團(tuán)聚體穩(wěn)定性下降，大團(tuán)聚體量不斷降低，小團(tuán)聚體量增加。

3.2 不同施肥處理對復(fù)墾土壤養(yǎng)分和酶活性的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，M處理的培肥作用較為明顯，有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷量較CK 增幅分別為12.02%、17.55%、22.45%，達(dá)到差異顯著水平，這與梁路等[5]的研究結(jié)論一致，一方面是因?yàn)橛袡C(jī)肥帶入土壤中一部分養(yǎng)分，另一方面是有機(jī)肥中含有的碳、氮的礦化速率遠(yuǎn)小于無機(jī)肥，因此有機(jī)肥的培肥效果要高于無機(jī)肥。W 處理的土壤有機(jī)質(zhì)和全氮量較CK 增加不明顯。

本試驗(yàn)中W 處理土壤脲酶活性增加最明顯，原因是供試尿素為酰胺態(tài)氮素，它強(qiáng)烈激發(fā)了土壤中脲酶活性[19]，但是脲酶活性過高會加速尿素水解而導(dǎo)致氮損失。也有研究表明無機(jī)氮肥會降低脲酶的活性的報(bào)道[20]，這可能與土壤類型、施肥量等因素有關(guān)系。土壤磷酸酶是一類加速有機(jī)磷轉(zhuǎn)化的水解酶，活性高低直接影響有機(jī)磷分解、轉(zhuǎn)化，W 處理由于含有較多的無機(jī)磷酸鹽，抑制了土壤中磷酸酶活性，有機(jī)肥中的有機(jī)磷直接激發(fā)了磷酸酶活性。于鎮(zhèn)華等[21]研究得出無機(jī)肥抑制了過氧化氫酶活性，添加有機(jī)肥可以起到緩解作用。與CK相比，M處理增強(qiáng)了轉(zhuǎn)化酶和磷酸酶的活性，因?yàn)橛袡C(jī)質(zhì)為酶提供合成底物[22]。有機(jī)肥本身C/N 超出了土壤微生物最佳范圍，配施無機(jī)肥（尿素）后，降低了土壤C/N，微生物生命活動更加旺盛，從而釋放更多的酶，因此WM處理土壤酶活性（脲酶除外）總體上略高于單施W 處理。

3.3 不同施肥處理對復(fù)墾土壤細(xì)菌群落組成的影響

細(xì)菌是土壤中數(shù)量最多（占總數(shù)70%～90%）、種類最豐富的微生物類群，幾乎參與了土壤中所有的生物化學(xué)反應(yīng)，對于維持土壤生態(tài)系統(tǒng)至關(guān)重要，其多樣性可以指示土壤的生物活性。費(fèi)裕翀等[23]研究發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥無機(jī)肥配施處理中土壤變形菌門、放線菌門的豐度明顯高于無機(jī)肥處理；聶三安等[24]研究得出有機(jī)無機(jī)配施放線菌的豐度顯著高于無機(jī)肥處理，然而WM處理顯著（p＜0.05）低于單施W 處理，根據(jù)劉平靜等[25]研究表明70%N 有機(jī)+30%N 無機(jī)配施降低了放線菌門的豐度，這可能與配施比例和土壤類型有關(guān)。變形菌門是土壤中主要的異養(yǎng)型細(xì)菌，依靠外界提供有機(jī)碳源才能生存，酸桿菌門和綠彎菌門則主要是自養(yǎng)型微生物，本試驗(yàn)中M、WM處理較CK 顯著（p＜0.05）提高了變形菌門豐度，同時降低了酸桿菌門和綠彎菌門的豐度，這與王齊齊等[26]的研究結(jié)論是一致的。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)受到土壤類型和質(zhì)地、pH值、施肥因素等多種因素的影響，pH值是主要影響因子[27]，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)土壤pH值沒有顯著變化，與細(xì)菌群落豐度相關(guān)性均不顯著，這可能與土壤類型、培肥時間、施肥量有關(guān)系。本試驗(yàn)得出體積質(zhì)量是影響復(fù)墾土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著因子之一，其對土壤的孔隙度及其大小分配有直接影響，改變土壤水、肥、氣、熱條件，因此也顯著影響了土壤微生物活性和群落結(jié)構(gòu)的變化[28]。土壤堿解氮、有機(jī)質(zhì)、全磷也是影響供試土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的顯著養(yǎng)分因子，C、N、P 是構(gòu)成細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)物質(zhì)，Coolon 等[29]研究表明氮素是影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最主要的因子。不論是有機(jī)氮肥還是無機(jī)氮肥，都可以直接抑制微生物的呼吸作用[30]，進(jìn)而影響到微生物種群生長、繁殖。長期單施無機(jī)肥的土壤微生物碳源代謝模式較為單一，缺乏容易利用的碳源導(dǎo)致微生物利用碳源能力降低，微生物物種衰減。長期單獨(dú)施用化肥導(dǎo)致某些土壤細(xì)菌種類富集或是某些種類的喪失[31]，配施有機(jī)肥則后改善了土壤微生物群落碳源代謝模式，提高了微生物群落碳源利用能力。

4 結(jié)論

1）M、WM處理均不同程度地降低了復(fù)墾土壤小團(tuán)聚體比例，同時顯著增加了較大團(tuán)聚體比例，改善了復(fù)墾土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)。

2）M處理顯著增加了復(fù)墾土壤有機(jī)質(zhì)和全氮、全磷、速效鉀和堿解氮量，且顯著增加了磷酸酶和轉(zhuǎn)化酶活性；W 處理則顯著提升了土壤全磷量和脲酶活性；WM處理則明顯增加了土壤全氮和速效養(yǎng)分。

3）土壤全磷、有機(jī)質(zhì)、堿解氮和體積質(zhì)量是造成土壤群落結(jié)構(gòu)差異的主要因子。