尚 雪, 羅 陽

(1. 遼寧省金秋醫(yī)院 口腔科, 遼寧 沈陽, 110000; 2. 中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院, 遼寧 沈陽, 110000)

牙周炎是臨床上常見的一種以牙周膜結締組織破壞和牙槽骨吸收為特征的慢性炎癥，常由宿主免疫反應和微生物感染引起。牙周炎的發(fā)生、發(fā)展與多種因素密切相關，包括年齡、性別和是否吸煙[1-2]。Qandil R[3]研究發(fā)現(xiàn)，吸煙是增加牙周探診深度的獨立危險因素，會影響牙周血液循環(huán)，進而導致齦下微生物菌群發(fā)生改變，齦溝液中多種細胞因子增加，最終造成牙周纖維結締組織破壞[4-6]。肝細胞生長因子(HGF)主要由間充質(zhì)細胞合成，并在炎癥反應中由單核細胞大量表達。Kakimoto 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，牙齦組織中的炎性細胞HGF表達量高，并認為在牙周袋的形成以及牙槽骨吸收的病理發(fā)展過程中HGF起到重要的調(diào)控作用。但關于HGF與慢性牙周炎炎癥程度的關系目前研究尚少。吸煙是牙周疾病產(chǎn)生及發(fā)展的主要誘發(fā)因素之一，研究[8-9]認為其可能會引起牙周局部的小血管收縮，進而影響體液和細胞免疫誘導炎癥反應。本研究觀察HGF在輕中重度慢性牙周炎牙齦組織中的表達水平以及與吸煙的關系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年8月—2019年8月遼寧省金秋醫(yī)院口腔內(nèi)科就診的慢性牙周炎患者110例作為慢性牙周炎組，其中輕中度者75例為輕中度慢性牙周炎組，平均年齡(46.24±6.29) 歲，重度35例為重度慢性牙周炎組，平均年齡(48.24±6.11) 歲; 不吸煙者55例，平均年齡(45.32±5.62) 歲，吸煙者55例，平均年齡(48.38±6.03) 歲。同時選取因第三磨牙阻生而拔除且牙周組織健康者110例作為對照組，其中不吸煙者84例，平均年齡(27.98±3.21) 歲; 吸煙者26例，平均年齡(24.67±4.32) 歲。所有吸煙者的吸煙年限為2～32年。納入標準: ① 近3個月內(nèi)無牙周病治療史及抗生素用藥史且無感染及其他全身性疾病; ② 牙周健康者的牙周組織無炎癥; ③ 慢性牙周炎組患者納入標準根據(jù)按美國牙周病協(xié)會(APP) 1999年制定的牙周炎分類標準[14], 并根據(jù)附著喪失(CAL) 將牙周炎分為輕中度(CAL≤3～5 mm)、重度(CAL>5 mm); ④ 所有參與患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗標本制備: 術前告知所有研究對象手術的具體取樣情況并簽署知情同意書。慢性牙周炎組于牙周翻瓣術中切取其牙齦組織; 對照組在拔除阻生牙時切取其健康牙齦組織。牙齦組織取到后立即進行磷酸緩沖鹽溶液(PBS) 沖洗3次，放入無酶EP管中，并置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)技術檢測HGF mRNA表達水平: 將牙齦組織樣本在液氮冷凍下充分研磨，加Trizol 裂解液進行細胞裂解，按照Trizol試劑盒說明書方法提取總RNA; 經(jīng)紫外分光光度計檢測確定其OD260/280在1.8～2.0后，用逆轉錄試劑盒合成cDNA。然后以cDNA為模板, β-actin為內(nèi)參抗體，用7500 RT-PCR儀進行PCR擴增?？偡磻w系20.0 μL, 分別為SyB 10.0 μL、RoX 0.4 μL、cDNA 2.0 μL, 上、下游引物(10.0 μmol/L)各0.8 μL, 雙蒸水(ddH2O) 6.0 μL。反應條件: 95 ℃, 30 s; 95 ℃, 5 s; 60 ℃, 34 s (40個循環(huán))+讀板，每個樣本設置3個平行孔。反應結束后，根據(jù)各樣本目的基因和內(nèi)參基因的反應CT值，采用2-△△CT法計算各樣本中HGF mRNA的相對表達量。各引物序列如下: HGF上游引物, 5′-TAAGAAGAGCACTGAGAGGTGGAA -3′, 下游引物: 5′-AATATCAGAGAGGTGGAA-3′, 產(chǎn)物長度180 bp。β-actin上游引物: 5′ -GAGCTACGAGCTGCCTGA CG-3′, 下游引物: 5′ -GTAGTTTCGTGGATGCCACAG -3′, 產(chǎn)物長度120 bp。所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用方差分析及LSD檢驗對各組吸煙者和不吸煙者的HGF mRNA表達水平進行比較。檢驗水準為α= 0.05。

2 結 果

2.1 2組牙齦組織中HGF mRNA表達水平比較

RT-PCR 檢測結果顯示，慢性牙周炎組牙齦組織中HGF mRNA的表達水平為(2.17±0.09), 顯著高于對照組的(1.04±0.07) (P<0.05)。

2.2 輕中重度慢性牙周炎患者牙齦組織中

HGF mRNA表達水平比較

輕中度、重度慢性牙周炎組牙齦組織中HGF mRNA的表達水平分別(1.71±0.08)、(3.00±0.09), 均顯著高于對照組的(1.04±0.07)(P<0.05); 且重度慢性牙周炎組牙齦組織中HGF mRNA的表達水平顯著高于輕中度慢性牙周炎組(P<0.05)。

2.3 吸煙對慢性牙周炎組及對照組牙齦組織中

HGF mRNA表達水平的影響

對照組和慢性牙周炎組中，牙齦組織中HGF mRNA的平均表達水平為吸煙者高于不吸煙者，其中以慢性牙周炎組中吸煙者的HGF mRNA表達水平最高，其表達水平由高到低依次為: 慢性牙周炎組吸煙者(3.03±0.15)>慢性牙周炎組不吸煙者(2.36±0.17)>對照組吸煙者(1.18±0.01)>對照組不吸煙者(1.00±0.07); 對照組吸煙者與對照組不吸煙者HGF mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 其他各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05) 。

3 討 論

HGF最早是從鼠的部分肝臟血清中分離出來的，之后又在鼠的血小板、肝細胞和人的血液中提取出來，是一種具有生物活性的生長因子。研究[15-18]發(fā)現(xiàn)，其在眼部組織中可由多種細胞產(chǎn)生，刺激眼內(nèi)多種其它細胞的生長和移行。在肌腱成纖維細胞中HGF依賴AMPK信號通路抑制肌纖維母細胞分化。研究[19]顯示, HGF在牙周炎患者的牙齦組織和牙周膜中存在過量表達。經(jīng)牙周基礎治療后，患者齦溝液中HGF水平可明顯下降。

本研究通過RT-PCR技術對慢性牙周炎組和健康牙齦組織中HGF mRNA的表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎組中HGF mRNA的表達量明顯顯著高于健康牙齦組織，差異有統(tǒng)計學意義。說明HGF在慢性牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起著一定的作用。在重度慢性牙周炎患者中，牙齦組織中HGF mRNA的表達水平顯著高于輕中度患者(P<0.05), 表明隨著牙周炎癥的加重，其牙齦組織中HGF mRNA的表達水平也相應升高。本研究還發(fā)現(xiàn)，無論是對照組還是慢性牙周炎組，其牙齦組織中HGF mRNA的表達水平均為吸煙者高于不吸煙者，且以慢性牙周炎組吸煙者HGF mRNA的表達水平最高。該結果證實吸煙可導致牙齦組織中HGF mRNA的表達水平升高，并可能會加重牙周炎癥。

綜上所述, HGF mRNA在慢性牙周炎患者牙齦組織中高表達，且與慢性牙周炎患者嚴重程度呈正相關，且吸煙患者中HGF的mRNA表達水平也高于非吸煙患者，提示吸煙可能通過上調(diào)HGF來誘發(fā)慢性牙周炎以及參與調(diào)控其疾病的進展過程，可作為標志物來診斷疾病。