李年生　陳立　肖祚庥　楊禹祺　艾可龍

摘 要 卵巢癌的死亡率高，是嚴重威脅女性健康的重大疾病。當前，由于缺乏有效、便捷的早期診斷技術(shù)，大部分卵巢癌患者被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)處于中晚期而錯失最佳治療時機。因此，對早期卵巢癌的快速、靈敏、低成本和準確檢測具有非常重要的意義。在早期卵巢癌患者血液中存在溶血磷脂酸（Lysobisphosphatidic acids， LPA）濃度升高現(xiàn)象，而在其它疾病中卻較少出現(xiàn)此情況，因此LPA可作為一種高特異性、有良好臨床應用前景的卵巢癌標志物。近年來， 該領(lǐng)域的相關(guān)研究取得了較大的進展， 開發(fā)了很多LPA的檢測技術(shù)和方法。本文對LPA的檢測方法進行分類、歸納和總結(jié)，著重介紹了近年來該領(lǐng)域的重要進展，最后對LPA標記物檢測在臨床應用方面所面臨的挑戰(zhàn)進行了分析， 對其發(fā)展和前景進行了展望。

關(guān)鍵詞 卵巢癌; 溶血磷脂酸; 癌癥標志物; 質(zhì)譜檢測; 比色檢測; 熒光檢測; 評述

1 引 言

卵巢癌是嚴重威脅女性健康的疾病[1，2]。由于卵巢癌早期缺少癥狀，篩查方法有限，因此其早期診斷比較困難。75%的卵巢癌患者就診時已為晚期，而晚期病例療效不佳（晚期卵巢癌患者5年生存率僅25%）[3～6]。因此，雖然卵巢癌的發(fā)病率居婦科惡性腫瘤的第三位，但其死亡率高居婦科癌癥首位。值得注意的是，早期確診的卵巢癌患者5年生存率為90%。因此，實現(xiàn)卵巢癌早期診斷，可以大幅度降低卵巢癌的死亡率。目前，臨床上卵巢癌診斷的方法主要包括影像學檢查（超聲成像、計算機斷層掃描、正電子發(fā)射斷層掃描及核磁共振成像等）、組織病理切片等。影像學檢查手段能夠明確盆腔腫塊是否存在，甚至能發(fā)現(xiàn)卵巢腫瘤，區(qū)分固體腫塊和液體囊腫，判斷腫塊的尺寸，以及觀察腫塊內(nèi)部的情況等。盡管如此，影像學檢查無法判定卵巢腫塊是良性或惡性，且其成本高、價格昂貴、普適性低。組織病理切片檢查需要通過手術(shù)切除選取標本，制成病理切片，用顯微鏡檢查病變。病理切片是卵巢癌確診的主要手段，但其缺點是需要手術(shù)、創(chuàng)傷性大，且無法發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶。這些影像學檢查、組織病理切片方法通常僅適用于中晚期卵巢癌病人的檢查。

通過體液檢測卵巢癌相關(guān)標志物是更為便捷、經(jīng)濟的方法[1，7，8]。卵巢癌標志物主要有人附睪蛋白4、癌抗原-125（Cancer antigen 125， CA-125）和間皮素等，其中CA-125在臨床上已被用于卵巢癌的篩查[9～11]。CA-125是一種糖類蛋白質(zhì)，中晚期卵巢癌患者的CA-125水平會升高，但是檢測CA-125對早期卵巢癌的篩檢并不適用，有些其它疾病或健康女性在特定生理周期也會引起血清中的CA-125水平升高。此外，在卵巢癌早期僅有25%左右的患者CA-125的水平升高[12]。因此，通過CA-125篩查早期卵巢癌具有高的假陽性和漏診率。溶血磷脂酸（Lysobisphosphatidic acids， LPA）在卵巢癌細胞的增殖、侵襲等方面發(fā)揮了重要作用。在卵巢癌早期，新血管增生對腫瘤的增殖至關(guān)重要。Song等[14]研究發(fā)現(xiàn)，LPA能誘導卵巢癌細胞高度表達血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor， VEGF），而VEGF能在腫瘤部位誘導血管新生。LPA能促使卵巢癌細胞增值轉(zhuǎn)錄因子（主要為叉頭框蛋白M1， forkhead box M1）表達，而直接誘導卵巢癌增殖[15]。另外，LPA能促進基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinase 9， MMP9）的表達，MMP9能促進卵巢癌轉(zhuǎn)移和侵襲[16]。這說明LPA在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[16～18]。據(jù)報道，卵巢癌早期患者血清中的LPA升高率達90%，而中晚期患者可達100%[19]。LPA是一種脂類物質(zhì)，易從血液、腹水、唾液等中提取，因而便于進行分析和檢測。上述結(jié)果表明， LPA是具有臨床應用前景的卵巢癌早期標記物。

基于LPA檢測的重要意義，大量檢測手段、生物探針被開發(fā)用于檢測LPA[12，20～33]。本研究組也構(gòu)建了聚丁二炔比色探針檢測血清中的LPA[21]。當前， LPA的檢測主要通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜與原子吸收光譜或質(zhì)譜聯(lián)用等方法實現(xiàn)[13，23，34～50]。這些方法具有靈敏度高、普適性好的優(yōu)勢，但缺點是耗時、操作復雜和成本高。LPA也可以通過熒光法、比色法和電化學發(fā)光等便捷、經(jīng)濟的方法進行檢測，然而它們的特異性和靈敏度需要進一步提高。近年來，由于納米技術(shù)、光譜技術(shù)的發(fā)展和應用，LPA檢測方法在靈敏度、特異性等方面取得了很大的進展。本文對LPA檢測主要方法進行分類闡述， 對相關(guān)檢測機理和影響因素進行了深入的探討，重點介紹了該領(lǐng)域最新進展，最后展望了LPA檢測在臨床應用中面臨的挑戰(zhàn)和機遇。

2 質(zhì)譜法檢測LPA

質(zhì)譜技術(shù)具有靈敏度高、準確性高、響應時間快、需要的樣本量少、通量高等優(yōu)點，被廣泛用于生物樣品的分析和檢測[51]，已經(jīng)成為生物樣品中脂質(zhì)分析的常規(guī)技術(shù)。

質(zhì)譜檢測LPA的準確性主要依靠分離技術(shù)。采用質(zhì)譜檢測體液（主要包括血液、尿液、唾液等）樣本中的LPA通常按照如圖1所示的流程[13]，分8個步驟進行。首先是樣本收集，然后經(jīng)過脂質(zhì)抽提和色譜分離后，再進入質(zhì)譜儀進行檢測和分析[52]。體液樣本中最普遍采用的是血液樣本。血液中LPA的豐度比溶血磷脂酰膽堿低兩個數(shù)量級，同時還包含與LPA具有類似結(jié)構(gòu)的溶血磷脂酰絲氨酸、磷脂酰膽堿等，這些脂質(zhì)分子都會對質(zhì)譜檢測LPA造成干擾。近年來，在LPA的抽提和分離方面的研究也取得了很大的進展。對于抽提方法，已從傳統(tǒng)的甲醇/氯仿脂質(zhì)液-液提取法（Bligh & dyer方法）發(fā)展到固-液提取法。對于分離方法，也從早期的毛細管電泳法、薄層色譜法等發(fā)展到高效液相色譜法等。目前，高效液相色譜法已經(jīng)成為分離LPA的常規(guī)方法。質(zhì)譜技術(shù)中，常規(guī)的電子碰撞電離、電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離技術(shù)都已被用于LPA的檢測。 本文將從抽提、分離方法和電離方式三個方面對質(zhì)譜法檢測LPA的最新進展進行歸納和總結(jié)。

2.1 LPA的抽提方法

通過質(zhì)譜法進行LPA檢測時，獲得高靈敏度和高準確性的最重要的一步是LPA抽提。不同于常見脂質(zhì)分子，LPA是一種兩親性分子，具有較大的極性。除了常規(guī)脂質(zhì)提取法（Bligh & Dyer方法）外，基于異丙醇、甲基叔丁基醚和丁醇等溶劑的方法也被用于提取LPA[53～56]。Triebl等[38]對比研究了Bligh & Dyer 方法、Bligh & Dyer鹽酸法、甲基叔丁基醚提取法和丁醇提取法（圖2） ，發(fā)現(xiàn)甲基叔丁基醚提取法效果較差，在提取過程中超過69%的LPA丟失;采用Bligh & Dyer 方法提取效果同樣較差，主要因為LPA的強極性導致其在甲基叔丁基醚和氯仿中的溶解度不高;因HCl能導致LPA質(zhì)子化而提高其在非極性溶劑中的溶解度，采用HCl修改的Bligh & Dyer 方法能大幅提高LPA的提取效率（提取率在91%～99%之間）。最近，Scherer等[42]發(fā)現(xiàn)，通過Bligh & Dyer HCl方法抽提LPA時，約2%的溶血磷脂酰膽堿在酸性條件下水解生成LPA?？紤]到溶血磷脂酰膽堿在血清中的濃度比LPA高兩個數(shù)量級，采用該方法會導致LPA水平人為升高。因LPA能在正丁醇中很好地溶解，通過正丁醇方法也能獲得較好的LPA提取效果。2019年，Aristizabal-Henao等[34]采用正丁醇抽提法不僅獲得了很好的LPA萃取效率， 且能大幅減少血樣體積，僅用50 μL血清樣本，即分離出LPA的多種異構(gòu)體。

除了液-液抽提法，固相萃取法在近年來也被用于萃取LPA。Wang等[57]使用分子印跡聚合物作為固相萃取的固定相，通過固-液抽提實現(xiàn)對LPA的高效提取。分子印跡是在固體或凝膠中產(chǎn)生印記的過程，其大小、形狀和電荷分布與模板分子相對應[58]。通常將模板分子與功能單體通過共價或非共價鍵結(jié)合，然后再高濃度交聯(lián)聚合。去除模板后形成具有空位和目標物結(jié)合位點的分子印跡聚合物，可選擇性地結(jié)合目標分子。通過這種方法，可快速和簡單地提取高純度的LPA，提取率超過94.6%，比液-液抽提法具有回收率更高、便捷和易于自動化操作的優(yōu)點。

2.2 LPA的分離

高效液相色譜法廣泛應用于生物、化學和環(huán)境等樣品分析，其核心是高效液相色譜柱[52， 59]。高效液相色譜柱一般分為正相柱和反相柱。正相色譜柱一般選擇極性的多孔球形硅膠填充。2016年， Cífková等[36]采用正相色譜柱分離LPA。通過對不同化學性質(zhì)的色譜柱、流動相的pH值、流動相添加劑的類型和濃度進行深入研究，發(fā)現(xiàn)當采用氫化二氧化硅柱、酸化處理（pH 4）時，高效液相色譜能有效分離脂類物質(zhì)，可獲得血清樣品中所有脂質(zhì)類（包括LPA）良好的色譜峰形狀。

相對于正相色譜柱，反相色譜柱具有更好的分離能力和穩(wěn)定性。在反相色譜法中，極性化合物先被洗脫，而非極性化合物因與吸附劑表面的親和性不同而被依次分離。目前，反相色譜柱已經(jīng)被廣泛用于分離磷脂分子[60～62]。LPA在反相柱中通常以長拖尾狀寬峰的形式被洗脫，導致LPA的分離、檢測和定量分析的效果較差。Ogiso等[45]通過使用含有低濃度H3PO4（5 μmol/L）和高比例水（40%）的起始流動相，可大幅減少LPA洗脫峰的拖尾，從而高效分離LPA。流動相中低濃度的H3PO4能促使LPA質(zhì)子化，從而減少極性而減少洗脫峰的拖尾。然而，H3PO4的引入會對隨后進行的質(zhì)譜分析造成干擾。LPA上的羥基基團與三甲基硅烷化重氮甲烷（Trimethylsilyl chloride， TMS）發(fā)生專一性強、效率高的反應[35，40，63，64]，易被甲基化而大幅減少分子極性，使其在反相色譜柱中易被分離。最近，王雪穎等[23]通過該反應對LPA進行甲基化修飾（圖 3A），可大幅改善LPA的色譜行為。如圖3B和3C所示，LPA的色譜峰具有很長的拖尾，而甲基化后的LPA色譜峰得到了明顯改善，色譜峰的拖尾減少，色譜峰的強度也大幅提高。

2.3 LPA的質(zhì)譜電離方法

在質(zhì)譜分析中，樣品電離一般在離子化器里進行。最常見的離子化器是電子離子化器。電子離子化是一種“硬”的電離方法，采用電子離子化器能產(chǎn)生大量碎裂片段而能提供詳細的質(zhì)譜信息，可為分子結(jié)構(gòu)表征提供重要信息。電子離子化器主要通過由鎢或錸加熱燈絲產(chǎn)生的電子束與樣品氣體分子碰撞時，解離一個電子而產(chǎn)生電離。在正常大氣壓的空氣中，有機物在加熱條件下會迅速燃燒，因此電子離子化器通常與氣相色譜聯(lián)用（在真空條件下），但不能與液相色譜或高效液相色譜（一般在正常大氣壓下）聯(lián)用。

通過高效液相色譜分離LPA時，一般采用較“軟”的離子化器。電噴霧電離和基質(zhì)輔助激光解吸電離是兩種“軟”電離方法[13]。這兩種電離法通常不會或很少產(chǎn)生分子碎片。基質(zhì)輔助激光解吸電離是利用基質(zhì)吸收激光的能量使樣品中的分子以最小的碎裂度產(chǎn)生離子[65，66]。例如，Tanaka等[31]采用氮分子激光器發(fā)射337 nm的激光作為能量來源以輔助電離樣品。然而該方法重現(xiàn)性不佳，為了提高重現(xiàn)性，每個質(zhì)譜樣本需要多次激光激發(fā)（平均需采用256次）。電噴霧電離是將含有分析物的液體通過電噴霧形成精細的氣溶膠，高溫去溶劑后將分析物離子化。電噴霧電離的最大優(yōu)勢是能便捷地與液相色譜分離技術(shù)聯(lián)用。相對于基質(zhì)輔助激光解吸電離，當前LPA的質(zhì)譜分析采用電噴霧電離更為普遍[19，67～73]。例如， Cífková等[36]通過高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用實現(xiàn)了對復雜樣品豬腦和腎中的LPA的分離和定量檢測。

3 光學方法檢測LPA

對于實際臨床檢驗來說，發(fā)展一種相對簡單有效檢測LPA的方法非常必要，因此操作簡便、低成本的光學方法因此受到廣泛的關(guān)注。基于光學檢測LPA的方法包括有電化學發(fā)光法、表面增強拉曼光譜法、熒光法和比色法等[12，19，21，22，26，30，33，56，74～80]，其中， 以熒光法和比色法為主。光學方法最大的瓶頸是選擇性和靈敏度。由于體液的成分復雜，光學探針應具有較好的抗干擾能力， 以確保對LPA的選擇性響應。另外，卵巢癌患者血清的LPA濃度介于1.3～50 μmol/L之間，臨界值為1.3 μmol/L[19]。因此，有臨床應用價值的光學探針需要具有很高的靈敏度，其檢出限應低于1.3 μmol/L。近年來，LPA光學探針在靈敏度、特異性等方面取得了很大的進展，本節(jié)對熒光法和比色法這兩種光學法進行歸納和總結(jié)。

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Progress in Detection of Biomarker of Ovarian

Cancer： Lysophosphatidic Acid

LI Nian-Sheng， CHEN Li， XIAO Zuo-Xiu， YANG Yu-Qi， AI Ke-Long*

（Xiangya School of Pharmaceutical Sciences， Hunan Provincial Key Laboratory of Cardiovascular Research，

Central South University， Changsha 410078， China）

Abstract Ovarian cancer is a serious threat to women's health， and its mortality rate is the highest in gynecological cancer. At present， there is a lack of effective and convenient early diagnosis technology for ovarian cancer. Most of the patients with ovarian cancer are found in the middle and late stage and miss the best time for treatment. Therefore， the rapid， sensitive， economic， and accurate detection of early ovarian cancer is of great significance. In recent years， lysophosphatidic acid （LPA） has been found to increase in serum in the early stage of ovarian cancer， but less in other diseases. Therefore， LPA is a promising and highly specific marker of ovarian cancer. To detect LPA， many detection techniques and methods have been developed. In recent years， great progress has been made in this field. This paper summarizes the detection methods of LPA， and focuses on the important progress in this field in recent years. Finally， the challenges and prospects of LPA detection in real clinical application are also prospected.

Keywords Ovarian cancer： Lysophosphatidic acid; Biomarker; Mass spectrometry; Colorimetry; Fluorescence detection; Review

（Received 20 June 2020; accepted 14 August 2020）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.21974134） and the Innovation-Driven Project of Central South University ， China （No. 202045005）.

2020-06-20收稿; 2020-08-14接受

本文系國家自然科學基金項目（No.21974134）和中南大學創(chuàng)新驅(qū)動項目（No.202045005）資助

* E-mail： aikelong@csu.edu.cn