黃成偉 潘翱

重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400051

絕經后骨質疏松癥是由于雌激素缺乏導致破骨細胞活性增強和破骨細胞凋亡率降低所致。白細胞介素-17、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α和干擾素-γ等細胞因子通過促進破骨細胞生成和抑制成骨細胞分化誘導骨丟失，導致骨密度急劇下降[1]。褪黑素(melatonin，MEL)是松果腺分泌的一種神經內分泌激素，具有廣泛的作用，包括調節(jié)睡眠、抗衰老、抗炎和抗氧化作用[2]。研究[3]表明，褪黑激素缺乏會導致骨吸收增加，這表明它可能對破骨細胞相關的過程有抑制作用。有研究[4]表明血清褪黑素水平與絕經后婦女的I型膠原相關，表明血清褪黑素水平降低與絕經后婦女骨丟失增加有關。然而，褪黑素在骨質疏松癥中的作用尚不完全清楚。因此，本研究的目的是研究褪黑素對骨質疏松模型大鼠炎癥細胞因子、RANKL/OPG比值的影響，以及褪黑素對骨密度的直接影響。

1 材料和方法

1.1 研究方案

將體重相近的3月齡Sprague-Dawley(SD)雌性大鼠，行雙側卵巢切除(建立雌激素缺乏性骨質疏松癥，OVX)或假手術(Sham)。對實驗動物按照機構動物倫理委員會(IAEC/87)的指導方針進行操作。將大鼠隨機分為4組，每組8只。A：假手術組(Sham組)，B：去卵巢組(OVX組)，C：去卵巢+β-雌二醇治療組[487.5 μg/(kg·d),OVX+E2組]，D：去卵巢+褪黑素治療組[50 mg/(kg·d),OVX+MEL組],藥物治療8周。褪黑素的實驗劑量根據先前的報告確定[2]。治療結束后，處死動物，取脛骨進行骨密度(bone mineral density, BMD)測定，對股骨進行細胞因子和基因表達分析。

1.2 方法

1.2.1骨密度檢測：使用DXA掃描測定大鼠脛骨骨密度、骨礦含量(BMC，g)、骨密度(BMD，g/cm2)和骨面積(Area，cm2)。將提取的骨骼清除軟組織，放入裝滿水的培養(yǎng)皿中至1 cm深。采用雙能X線骨密度儀(DXA)對感興趣區(qū)(ROI)進行骨密度掃描，采用Hological Discovery QDR小動物高分辨率準直儀進行掃描和分析。

1.2.2基因表達分析：使用美國Sigma公司的TRIzol試劑結合PureLink RNA Mini Kit(Invitgen)從股骨近端分離總RNA。純化的總RNA用DNase I(Sigma)處理，然后按照制造商的說明使用cDNA合成試劑盒(RevertAid TM H減去First Strand cDNA合成試劑盒，美國Fermentas Life Sciences)進行cDNA轉化。以合成的cDNA為模板，檢測RANK1、OPG、IL-23 A和IL-17 A基因的表達，并與β-肌動蛋白基因表達進行對照。所使用的引物、登記號、產物大小和TM如表1所示。通過SYBR Green方法使用實時PCR對各種基因的基因表達進行相對定量。采用比較CT法計算相對基因表達量。

表1 研究基因核酸引物序列Table 1 Sequence of oligonucleotide primers used for studying genen

1.2.3骨組織腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β檢測：切開股骨近端，稱其重量。將其粉碎成粉末，懸浮在PBS(含蛋白酶抑制劑)中?；旌衔镌? 500 r/min、4 °C下離心2 min。收集上清液，參照廠家方案(Ray Biotech用于腫瘤壞死因子-α，PeproTech用于IL-1β)用雙抗體夾心ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-1β，蛋白質水平使用聯(lián)苯膽酸(BCA)法測定。

1.3 統(tǒng)計學分析

數據以均數±標準差表示。采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析(ANOVA)計算各組數據之間差異，并在兩組之間進行Bonferroni分析，P值<0.05表示比較差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 褪黑素對去卵巢大鼠骨密度的影響

去卵巢大鼠骨密度由假手術組的0.094 g/cm2降至0.051 g/cm2。然而，當去卵巢大鼠使用褪黑素時，骨密度增加到0.079 g/cm2。見表2。

表2 褪黑素處理對去卵巢大鼠骨密度的影響Table 2 The effect ofmelatonin treatment on bone mineral density in the ovariectomized animals

2.2 褪黑素對骨質疏松大鼠股骨RANKL/OPG比值的影響

基因表達分析顯示，與假手術組相比，去卵巢大鼠股骨中RANKL的表達顯著增加(P<0.000 1)，而去卵巢動物經褪黑素和β-雌二醇治療后，RANKL的表達明顯降低(P<0.000 1)，見圖1 A。雖然這些治療對OVX大鼠骨保護素(OPG)的相對基因表達沒有顯著影響(圖1B)，但與OVX組(圖1C)相比，治療組的RANKL/OPG比值顯著降低(P<0.001)。

圖1 褪黑素和雌二醇對RANKL/OPG比的影響 A：褪黑素和雌二醇治療組中RANKL基因表達的相對變化；B：褪黑素和雌二醇治療組中OPG基因表達的相對變化；C：RANKL/OPG比。注：***P<0.001。Fig.1 Effect of Melatonin and estradiol on RANKL/OPG ratio

2.3 褪黑素對骨質疏松模型大鼠股骨IL-23和IL-17家族成員表達水平的影響

褪黑素治療去卵巢大鼠顯示IL-23的表達顯著降低(圖2 A)。分析治療組和未治療組促炎癥細胞因子IL-17 A的相關基因表達，結果顯示，IL-17 A在去卵巢動物體內的表達增加(圖2B)。然而，β-雌二醇和褪黑素治療能有效降低去卵巢大鼠IL-17 A表達(圖2B)。褪黑素處理后IL-17B和IL-17F的表達沒有任何變化(圖2C、圖2D)。

圖2 褪黑素和雌二醇對IL-23和IL-17表達的影響注：褪黑素處理組和未處理組中IL23(A)、IL-17 A(B)、IL-17B(C)和IL-17F(D)基因表達的相對變化。Fig.2 The effect of melatonin and estradiol on the expression of IL-23 and IL-17

2.4 褪黑素對白細胞介素-1β和腫瘤壞死因子-α的影響

卵巢切除后，IL-1β和腫瘤壞死因子-α水平明顯升高。雌二醇和褪黑素均能顯著降低IL-1β和TNF-α(圖3 A、圖3B)。腫瘤壞死因子-α水平在去卵巢動物體內升高明顯升高，褪黑素治療后則顯著降低(P<0.001)。雌二醇對腫瘤壞死因子-α水平沒有任何影響(圖3B)。

圖3 褪黑素和雌二醇治療對IL-1β和TNF-α水平的影響Fig.3 The effect of melatonin and estradiol on the levels of IL-1βand TNF-α A： IL - 1β；B： TNF-α。

3 討論

骨質疏松癥的特征是由于骨吸收增強而導致骨量減少，骨形成降低。絕經后雌激素缺乏或卵巢切除引起的骨骼改變可以在去卵巢嚙齒動物模型中得到很好的研究。雌激素缺乏導致成骨細胞和破骨細胞動力學失衡，導致骨微結構改變。褪黑素主要在黑暗中由松果體分泌，在睡眠、晝夜節(jié)律、免疫反應、生殖控制和腫瘤生長抑制中起關鍵作用[2]。越來越多的證據[2]表明褪黑素對骨骼健康起著有益作用。褪黑素已被證明通過激活細胞外信號調節(jié)激酶1/2信號通路促進人骨髓間充質干細胞的成骨分化[5]，更重要的是，褪黑素可以通過抑制核因子κ-輕鏈-活化B細胞輕鏈增強器(NF-κB)信號通路來抑制破骨細胞的分化[6]。在松果體切除的動物中，已經觀察到BMD的下降和骨微結構的惡化[7]。這些結果顯示褪黑素可能對骨質疏松癥有治療效果。

DXA掃描顯示去卵巢大鼠骨密度明顯降低，提示骨質疏松模型建立成功。去卵巢大鼠使用褪黑素治療后，脛骨骨密度明顯增加。NF-κB受體激活劑是腫瘤壞死因子家族的成員之一，由成骨細胞分泌，促進破骨細胞的形成、分化和活化，導致骨丟失。RANKL與破骨細胞RANK的結合受其可溶性誘餌受體—護骨素(OPG)的調節(jié)。它的表達受糖皮質激素、甲狀旁腺素和各種細胞因子的調節(jié)，如IL-1、IL-6、IL-11和腫瘤壞死因子-α[8]。在本研究中，雖然OPG的表達沒有受到影響，但在OVX大鼠中觀察到RANKL的表達顯著增加，導致RANKL/OPG比值凈增加。研究[9]表明，雌激素刺激OPG的產生，在缺乏雌激素的情況下，RANKL是參與破骨細胞形成和隨后的骨丟失的主要分子。褪黑素和雌激素治療可以恢復RANKL水平，與Sham組相似，導致治療動物RANKL/OPG比值降低。最近的一項研究[10]也觀察到了類似的結果，使用抗氧化劑可以降低RANKL的表達，增加了OPG的表達，表明褪黑素對去卵巢大鼠的破骨細胞分化和活性具有預防作用。

IL-17是一種促炎細胞因子，由輔助性T細胞(Th17細胞)在轉化生長因子β、IL-6、IL-1β和IL-23的作用下產生。IL-23是IL-12家族的成員，可誘導IL-17的產生。用抗VD3/CH28單抗刺激Th細胞，在IL-23存在下分離出分泌IL-17的Th17細胞。這些細胞在RANKL和M-CSF存在的情況下導致破骨細胞形成[11]。Th17細胞的確切功能在小鼠(IL-17/和IL-23/)上進行的基因敲除研究中或在自身免疫性關節(jié)炎中使用抗IL-23抗體進行了描述，表明Th17是治療骨骼退行性疾病的強大靶點[12]。從這些研究可以得出結論，Th17細胞通過IL-23刺激而增殖，并且在T細胞介導的破骨細胞形成中起著至關重要的作用。卵巢切除后Th17細胞增多，通過產生IL-17刺激破骨細胞生成，導致骨質疏松。IL-17還增加腫瘤壞死因子α、IL-6和RANKL的表達，這些都是由成骨細胞產生的促破骨細胞因子。這些效應被雌二醇治療逆轉[13]。在本研究中觀察到去卵巢大鼠IL-17 A的表達水平升高。褪黑素治療可使去卵巢大鼠細胞因子水平顯著降低，提示褪黑素可能通過調節(jié)細胞因子IL-17 A起到骨保護作用。然而，與褪黑素治療的大鼠相比，雌二醇治療組出現IL-17 A水平下降更為明顯。IL-23也顯示出與Th17細胞因子相似的結果。

研究表明，IL-1、IL-6、IL-17、TNF-α等促炎細胞因子通過增加破骨細胞數量，增加骨吸收速率，參與絕經后骨質疏松癥的發(fā)生。IL-1β對骨吸收也有很強的刺激作用。IL-1β上調RANKL的產生，通過調節(jié)破骨細胞的分化、激活和存活來增強其活性并刺激破骨細胞的生成，從而導致骨吸收[14]。此外，IL-1β通過增加骨內前列腺素(PGE_2)合成刺激骨吸收，上調RANKL表達，從而調節(jié)破骨細胞壽命。腫瘤壞死因子α通過其在骨髓基質細胞和破骨細胞前體細胞上的表達促進骨吸收。腫瘤壞死因子α暴露于基質細胞會導致破骨因子的產生，如RANKL、M-CSF和IL-1[15]。在促炎環(huán)境中，這些過程共同增加了破骨細胞的壽命和數量，導致骨吸收增加。IL-1、β與腫瘤壞死因子-α在炎癥性破骨細胞形成過程中關系密切。在破骨形成過程中，IL-1α上調了腫瘤壞死因子-β的許多反應，提示完全抑制IL-1β和腫瘤壞死因子-α活性可以完全阻止骨吸收[16]。在本研究中，去卵巢大鼠骨IL-1β和TNF-α顯著升高，這可能與去卵巢誘導的氧化應激有關。褪黑素可顯著降低骨組織中IL-1β和TNF-α水平。這些結果提示，褪黑素對去卵巢大鼠骨吸收的抑制作用可能與其降低IL-1、β和TNF-α水平有關。

綜上，雌激素和褪黑素可調節(jié)去卵巢大鼠RANKL/OPG、IL-23和IL-17的表達。褪黑素可顯著降低去卵巢動物骨骼中IL-1、β和TNF-α的水平。但是本研究也有其不足之處，體現在研究時間較短以及組別較少，沒有進一步和其他抗氧化劑藥物比較，后續(xù)將進一步研究褪黑素改善骨質疏松癥的作用機制。