孫平 李風英 楊國柱 韓曉蕊 陳鎮(zhèn)秋 何偉 洪郭駒,7* 郭姣

1.廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 廣州 510080 2.青島市即墨區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，山東 青島 266200 3.廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006 4.華南理工大學醫(yī)學院，廣東 廣州 510006 5.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科，廣東 廣州 510405 6.廣州中醫(yī)藥大學嶺南醫(yī)學中心國家重點學科中醫(yī)骨傷科學實驗室，廣東 廣州 510405 7.加拿大阿爾伯塔大學醫(yī)學院骨外科部，加拿大 埃德蒙頓 T6G 2R3 8.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006

糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)是由于長期使用糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid,GC)所導致的骨代謝紊亂，主要表現(xiàn)為血清游離脂肪酸含量增高、骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性增加和易于骨折[1-2]。在10個國家進行的全球骨質(zhì)疏松癥婦女縱向研究[3-4]中，有4.6%的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者正在服用GC。在GIOP的研究當中，GC介導β-catenin是調(diào)控骨代謝、促進骨形成的關(guān)鍵節(jié)點。而在近期的研究[5]中發(fā)現(xiàn)，除了經(jīng)典的Wnt信號通路外，還存在促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶2(mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2, MEKK2)的調(diào)控通路，有效地抑制β-catenin泛素化，維持β-catenin的穩(wěn)定。

在前期研究中，筆者團隊發(fā)現(xiàn)以貞術(shù)調(diào)脂膠囊(FTZ)為代表的“補腎祛濕”法對治療GIOP有著優(yōu)良的治療效果，對于抑制骨丟失、保存在體骨量有明顯的效果[6-8]。更重要的是，筆者團隊初步發(fā)現(xiàn)了FTZ對GIOP中的MEKK2-Wnt偶聯(lián)存在調(diào)控作用，從而拮抗GC副作用，改善骨微環(huán)境的骨脂代謝功能，促進成骨分化和抑制骨丟失[9]。鑒于此，本研究進一步通過CRISPR/Cas9技術(shù)建立Mekk2敲除C57BL/6 J小鼠，并提取小鼠原代成骨細胞，添加FTZ含藥血清進行干預，經(jīng)與野生型小鼠成骨細胞比較，更深層次地挖掘FTZ拮抗GC抗GIOP的內(nèi)在分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1Mekk2小鼠敲除方法與鑒定：采用CRISPR/Cas9技術(shù),利用非同源重組修復引入突變的方式，造成Mekk2基因蛋白讀碼框移碼，功能缺失，敲除設(shè)計策略見圖1。具體操作如下：通過體外轉(zhuǎn)錄的方式，獲得Cas9 mRNA和gRNA。將Cas9 mRNA和gRNA(Cas9和gRNA體外轉(zhuǎn)錄信息見表1)顯微注射到C57BL/6 J小鼠的受精卵中，獲得F0代小鼠。在獲得F0代小鼠后，經(jīng)PCR產(chǎn)物測序確認，共獲得8只目的基因蛋白讀碼框移碼的F0代小鼠；選取陽性的F0代小鼠分別與野生型C57BL/6 J小鼠交配，獲得的F1代小鼠。鑒定方法同F(xiàn)0代小鼠鑒定。選取F1代剛出生乳鼠用于原代成骨細胞提取，選取F1代的6-8周敲除小鼠用于MicroCT檢測。

圖1 Mekk2敲除策略示意圖Fig.1 Schematic diagram of Mekk2 knockout strategy

表1 在Mekk敲除中的Cas9和gRNA體外轉(zhuǎn)錄信息Table 1 The transcription information of Cas9 and gRNA in Mekk2 knockout

1.1.2野生型乳鼠來源及培育條件：用于受精培育、MicroCT及含藥血清制備的小鼠為C57BL/6，雌雄均有，SPF級，6～8周齡，小鼠體重18～20 g；用于原代成骨細胞提取的乳鼠為C57BL/6品系的5 d大乳鼠。由廣州中醫(yī)藥大學動物實驗中心[SCXK(粵)2013-0001]標準飼養(yǎng)，實驗過程中對動物的處置符合中國科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。培育條件室溫控制在23 ℃～25 ℃, 相對濕度50%～60%, 光照時間07:00～19:00, 自由飲水及進食。

1.2 方法

1.2.1MicroCT檢測小鼠骨組織表型：將6～8周野生型小鼠和Mekk-/-小鼠處死后取右側(cè)脛骨，置于Micro-CT平臺上，從脛骨近端掃描至遠端，得出整個脛骨的3D重建層面圖片。通過Micro-CT自帶計算機分析系統(tǒng)根據(jù)所創(chuàng)建圖片的有效信息，依次計算骨表面積與骨骼體積比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(Tb.N)、骨小梁間隙(Tb.Sp)。

1.2.2FTZ含藥血清制備：小鼠(共10只)先適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，給藥前將小鼠禁食6 h。將復方貞術(shù)調(diào)脂膠囊(購自廣東藥科大學附屬第一醫(yī)院)剖開，參照人用藥量及所規(guī)定的人與鼠體表面積關(guān)系得出小鼠所需的等效劑量，以5倍等效劑量對小鼠進行藥物灌胃，2次/d，連續(xù)7 d。末次灌胃1 h后，行淺麻醉，心臟取血1～2 mL。室溫靜置30 min后取上清液，3 000 r/min離心15 min，分離血清，取上清液,冰凍保存?zhèn)溆?。每次使?0 %含藥血清(1 mL培養(yǎng)液中添加0.1 mL含藥血清)作為添加量。

1.2.3成骨細胞培養(yǎng)和分化測定：通過膠原酶II消化從5 d的新生乳鼠頭蓋骨中分離出細胞。將細胞在含有抗壞血酸和β-甘油磷酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以分化成原代成骨細胞。將原代成骨細胞培養(yǎng)于含有10 %FBS、2 mmol/L 1-谷氨酰胺、1%青霉素/鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基中。

1.2.4免疫沉淀(PI)實驗：用裂解液裂解成骨細胞，測定蛋白濃度，向蛋白上清液中加入1.0 μg IgG和80 μL protein A/G珠子孵育，離心后取上清，加入10 μL抗體沉淀p-MEKK2/3和MEKK2并孵育過夜，再加入80 μL A/G-珠子孵育，收集免疫沉淀物，加入緩沖液，剩余步驟同1.2.5。

1.2.5Western blot實驗：將細胞裂解液與緩沖液混勻形成樣品，吸取樣品與預染蛋白marker注入電泳，350 mA轉(zhuǎn)膜3 h。隨后5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗(β-catenin及p-β-catenin，均按照廠家說明稀釋，Sigma公司，美國)。經(jīng)孵育過夜后，TBST洗滌并加入相應(yīng)二抗。最后在凝膠成像系統(tǒng)中進行曝光和成像分析。

1.2.6Luciferase報告實驗：將0.5 μg的TOPflash質(zhì)粒和50 ng海腎熒光素酶質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染在12孔板上生長的C3H10T1/2細胞(Thermo Fisher Scientific公司，美國)。轉(zhuǎn)染24 h后按空白對照組、FTZ含藥血清、Wnt3蛋白(Sigma公司，美國)以及FTZ含藥血清和Wnt3共同干預，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，隨后裂解細胞，并使用雙重熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)獲得標準化的熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學處理

計量資料以均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示, 所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理。組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Mekk2+/-小鼠構(gòu)建與鑒定

經(jīng)受精卵顯微注射，本研究共獲得38只F0代小鼠。通過PCR的方式，對F0代小鼠的基因型進行鑒定，共獲得8只目的基因蛋白讀碼框移碼的陽性F0代小鼠；F0代小鼠PCR產(chǎn)物,經(jīng)測序，陽性F0代陽性小鼠(1號和16號)分別與野生型C57BL/6 J小鼠交配，最終獲得6只F1代雜合子小鼠(Mekk2+/-)。

2.2 Mekk2-/-小鼠培育

將獲得的Mekk2+/-小鼠(Mekk2+/-)分成兩部分：一部分雜合子小鼠與野生型小鼠交配，擴群繁育較多的Mekk2+/-小鼠；一部分雜合子小鼠自交，獲得基因敲除純合子小鼠(Mekk2-/-)，本實驗最后共獲得Mekk2-/-乳鼠20只用于原代細胞提取。

2.3 Mekk2-/-小鼠與野生型小鼠表型差異

采用MicroCT對Mekk2-/-小鼠與野生型小鼠進行骨組織的表型檢測。結(jié)果提示，Mekk2-/-小鼠與野生型小鼠相比，前者BV/TV、Tb.N、Tb.Th值降低(P=0.014，P=0.035，P=0.028)，Tb.sp無差異變化(P=0.084)。見表2。

表2 MicroCT檢測Mekk2-/-小鼠與野生型 小鼠骨組織Table 2 MicroCT detects the bone tissue of Mekk2-/- mice and wild type mice

2.3 FTZ含藥血清激活MEKK2以穩(wěn)定成骨細胞中的β-catenin

分別加入FTZ含藥血清以刺激野生型小鼠成骨細胞和Mekk2-/-成骨細胞，干預時間為10、20、40 min，并通過Western blot分析β-catenin(S675)的磷酸化水平。結(jié)果提示，F(xiàn)TZ含藥血清在40 min時可增強野生型小鼠細胞β-catenin(S675)的磷酸化水平(P=0.026)，但是在Mekk2-/-小鼠細胞中則明顯降低，特別是在40 min時(P=0.032)。見圖2。

圖2 FTZ含藥血清促進β-catenin磷酸化水平 A：FTZ含藥血清添加到野生型(WT)小鼠和Mekk-/-小鼠的成骨細胞，干預時間在0、10、20、40 min不等，Western blot檢測p-β-catenin表達水平；B：p-β-catenin與β-catenin表達水平比率。Fig.2 FTZ containing serum promotes phosphorylation of β-catenin A：FTZ containing serum is added into the primary osteoblast of wild type mice and Mekk2-/- mice at 0, 10, 20, 40 mins. Western blot is used to detect the expression of p-β-catenin；B：the ratio of p-β-catenin and β-catenin.

2.4 FTZ含藥血清誘導MEKK2磷酸化

在野生型小鼠原代細胞中，采用FTZ含藥血清和FGF2(誘導MEKK2的激活因子)對細胞進行干預。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ含藥血清和FGF2干預后的原代細胞中，p-MEKK2/3表達水平均比不干預時細胞增強(P=0.003，P=0.008)，且二者提高水平不存在明顯差異(P=0.062，P=0.071)。見圖3。

2.5 FTZ含藥血清促進β-catenin活化

將TOPflash質(zhì)粒和海腎熒光素酶質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染入C3H10T1/2細胞中。用FTZ含藥血清或Wnt3a以及二者共同干預細胞。結(jié)果提示，F(xiàn)TZ含藥血清和Wnt3a均促進β-catenin活化，而FTZ含藥血清和Wnt3a共同干預細胞后，可見β-catenin活化程度更高，效果呈累加效應(yīng)(P<0.05)。見圖4。

圖3 FTZ含藥血清誘導MEKK2磷酸化 A：FGF2(25 ng/mL)與FTZ含藥血清共同干預野生型小鼠原代成骨細胞，并用免疫沉淀技術(shù)檢測p-MEKK2/3和MEKK2表達；B：p-MEKK2/3和MEKK2表達水平比率。Fig.3 FTZ containing serum induces phosphorylation of MEKK2 A:FGF2 (25 ng/mL) and FTZ containing serum are added into the primary osteoblast of wild type mice. Immunoprecipitation is used to detect the expression of p-MEKK2/3；B: the ratio of p-MEKK2/3 and MEKK2.

圖4 FTZ含藥血清和Wnt3a促進β-catenin活化Fig.4 FTZ containing serum and Wnt3a promoteβ-catenin activation

3 結(jié)論

GIOP的發(fā)生和發(fā)展密切關(guān)系著骨吸收破壞的平衡穩(wěn)定或者失衡，通過藥物尋求再平衡至關(guān)重要[10]。從細胞層面上看，GC抑制Wnt/β-catenin經(jīng)典通路，加速β-catenin磷酸化降解，從而激活泛素系統(tǒng)，是造成GIOP的重要環(huán)節(jié)和基礎(chǔ)分子機制。當GC超量時，抑制β-catenin泛素系統(tǒng)的上游機制被阻斷，可抑制Wnt下游因子[11-12]，激活Wnt抑制因子[12-17]，更可以抑制Wnt自身表達[18]。而最新的研究發(fā)現(xiàn)，MEKK/SET11亞家族成員MEKK2可有效地抑制β-catenin的泛素化。研究[5]指出，由FGF2所激活MEKK2可以通過USP15的募集，從有別于Wnt經(jīng)典通路之外，實現(xiàn)抑制β-catenin泛素化的效果，從而阻止其組成蛋白酶產(chǎn)生周轉(zhuǎn)。這一種創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)，提出了MEKK2的正向調(diào)控對實現(xiàn)細胞內(nèi)β-catenin的穩(wěn)定性具有開拓性意義?；诖耍P者團隊認為，如果能尋找到正向介入MEKK2通路的效用藥物，即可以發(fā)揮與Wnt經(jīng)典通路同樣的預期效果。

在既往的研究當中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ中藥方劑的效用機制契合GIOP骨脂代謝分子機制，在生物表型上能夠系統(tǒng)解決骨組織內(nèi)脂肪沉積，成骨活性減弱，骨代謝紊亂等[6-8]。這也是FTZ作為降脂類中成藥在骨科領(lǐng)域的發(fā)展。筆者團隊經(jīng)研究進而發(fā)現(xiàn)，在GIOP模型當中，F(xiàn)TZ不僅提高了骨量，抑制了骨質(zhì)疏松的進展，同時還調(diào)控骨組織內(nèi)Wnt3a、MEKK2、β-catenin蛋白表達，這提示FTZ通過MEKK2-Wnt偶聯(lián)信號通路從而促進GIOP成骨功能。在細胞層面也證實了這一點，F(xiàn)TZ同時促進了β-catenin和MEKK2的蛋白表達。另外，研究[9]還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ可增強β-catenin/TCF/LEF轉(zhuǎn)錄活性，從而激活Wnt/β-catenin信號通路下游靶基因的表達。

基于上述研究基礎(chǔ)，筆者團隊更深入地通過建立Mekk2-/-小鼠，經(jīng)與野生型小鼠比較，觀察成年小鼠的表型改變。結(jié)果顯示，Mekk2-/-小鼠的成骨量比野生型小鼠減少，盡管在重建當中未見骨小梁的結(jié)構(gòu)紊亂，但是Mekk2-/-小鼠因缺少Mekk基因而導致骨發(fā)育的遲緩與不足是明顯的，這與文獻當中的結(jié)論是一致的。本研究又通過提取Mekk2-/-小鼠和野生型小鼠的原代成骨細胞，研究FTZ對于β-catenin磷酸化的作用。結(jié)果表明，F(xiàn)TZ在Mekk2-/-小鼠的成骨細胞中，β-catenin磷酸化的水平相比野生型的細胞下降，這提示FTZ確系通過激活MEKK2發(fā)揮穩(wěn)定成骨細胞內(nèi)β-catenin水平，抑制β-catenin泛素化的作用。另外，已知FGF2是激活MEKK2的重要因子，而在與FTZ的比較當中提示，F(xiàn)TZ與FGF2所能促進MEKK2磷酸化的水平基本一致，這提示FTZ或直接或通過FGF2間接激活MEKK2活性。最后，通過Luciferase報告實驗，團隊發(fā)現(xiàn)FTZ與Wnt3a均可以促進β-catenin活化，當二者結(jié)合干預，可出現(xiàn)β-catenin活化的疊加效應(yīng)，因此提示FTZ具有獨立于Wnt經(jīng)典通路，通過作用于MEKK2來發(fā)揮效應(yīng)的。通過與之前研究的比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TZ在分子層面的藥理作用是整體性的，即作用于Wnt通路又作用于MEKK2通路，但是二者相互獨立，又相互配合，最終起到了β-catenin去泛素化的效果。

綜上所述，F(xiàn)TZ可以作為一個較為理想的藥物，既促進Wnt/β-catenin通路，又通過對MEKK2的正向調(diào)控作用，避免了Wnt或其同源受體的因激活而過度冗余，消除信號傳導過程中多種混雜因子參與，減少Wnt /β-catenin通路的消極表型[19]，從而實現(xiàn)治療GIOP的良好作用。