李洪杰 母潤紅

(北華大學基礎醫(yī)學院，吉林132011)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是終末分化的B細胞惡性增殖性疾病，約占所有癌癥的2%，所有血液學惡性腫瘤的10%，且其發(fā)病率逐年上升。僅在英國，2016年就有5 540人被確診，3 079人死亡，患者初次確診時中位年齡約為65歲[1]。骨髓瘤細胞的存活、生長和增殖依賴于骨髓微環(huán)境，與正常漿細胞不同，骨髓瘤細胞分泌的IgM抗體，可作為MM患者的診斷標志[2]。外周血惡性漿細胞比例 >20%稱為漿細胞白血病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為：高鈣血癥、腎功能不全及貧血。MM是一種多步驟性疾病，起初以無癥狀的單克隆丙種球蛋白病(MGUS)為特征，MGUS占成年人口的1%，每年約有1%的MGUS患者轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒訫M[3]。干細胞移植給MM患者帶來了希望，但MM目前仍然很難治愈。蛋白酶體抑制劑和免疫調(diào)節(jié)藥物的應用在過去幾年大幅提高了MM患者生存率。本文回顧了MM患者骨髓的重要免疫成分，描述了微環(huán)境中不同組分在免疫系統(tǒng)中的相互作用(圖1)，最后，對MM的治療方式進行了綜述。

1 骨髓微環(huán)境的組成及作用

骨髓瘤細胞間的相互作用和骨髓微環(huán)境對骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療至關重要，微環(huán)境中包含多種細胞類型,包括造血細胞(B細胞、T細胞、自然殺傷細胞、骨髓來源的抑制細胞和破骨細胞)和非造血細胞(骨髓基質(zhì)細胞、成骨細胞和內(nèi)皮細胞)。這些細胞共同分泌多種因子，這些因子可促進MM細胞的遷移和增殖，也可促進骨損傷[4]。

骨髓為正常漿細胞提供生存環(huán)境的同時，也保護了惡性漿細胞。MM細胞向骨髓的遷移類似于成熟漿細胞的歸巢，趨化因子基質(zhì)衍生因子-1 (SDF-1或CXCL12)是骨髓瘤細胞向骨髓遷移的關鍵調(diào)控因子[5]。內(nèi)皮細胞可能參與MM細胞的遷移，內(nèi)皮細胞分泌細胞外嗜環(huán)素A，與MM細胞表面的CD147結(jié)合，促進細胞遷移[6]。MM患者的廣泛性骨病是由于破骨細胞活性增加、數(shù)量增多、成骨細胞活性降低和數(shù)量減少所致。研究發(fā)現(xiàn)，MM細胞與骨髓基質(zhì)細胞和成骨細胞的相互作用導致RANKL(NF-κB配體的受體激活劑，又稱TNFRSF11B)水平升高和骨保護素水平降低。RANKL連接 RANK(NF-κB的受體激活劑，又稱TNFRSF11A),由破骨細胞前體表達，導致破骨細胞分化增加，骨保護素水平降低，使有效RANKL水平升高[7]。破骨細胞和成骨細胞數(shù)量及活性的不平衡導致骨的破壞和骨病的發(fā)生。

外泌體可能在微環(huán)境和MM細胞的相互作用中發(fā)揮作用。在患者中發(fā)現(xiàn)，來自骨髓基質(zhì)細胞的外泌體中某些miRNA(如miR-15a)的含量低于健康個體，可能會影響腫瘤的生長和發(fā)育，因為miR-15a被認為是一種抑制腫瘤的miRNA[8,9]。由骨髓基質(zhì)細胞及破骨細胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)是一種強大的血管生成因子，通過增加局部血管的豐度來增加氧氣供應，臨床上已表明微血管密度增高提示預后不良[10]。在血管內(nèi)，內(nèi)皮細胞和壁細胞創(chuàng)建了一個微環(huán)境，影響了許多干細胞和祖細胞的行為[11]。

體外研究證明巨噬細胞作為微環(huán)境的重要組成部分，可促進T細胞分化，抑制腫瘤細胞生長，同時調(diào)整性T細胞(Treg)也可抑制微環(huán)境中的抗腫瘤免疫[12]。在骨髓中，IL-6在支持MM生長中起重要作用。目前證明IL-6來源于髓系細胞，主要為髓系前體細胞。此外，骨髓瘤細胞誘導骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)、成骨細胞及未成熟的髓系細胞產(chǎn)生IL-6，從而促進自身增殖。IL-6在正常漿細胞中促進免疫球蛋白產(chǎn)生，同時，在MM細胞中發(fā)揮促進增殖和抗凋亡作用，從而保護骨髓瘤細胞并促進腫瘤細胞增殖[2,13,14]。

圖1 MM骨髓微環(huán)境Fig.1 MM bone marrow microenvironmentNote:A.MM cells；B.BM stromal cell；C.Osteoblast；D.Osteoclast；E.Dendritic cell;F.CD4 T cell；G.CD8 T cell；H.NK cell；I.Tregs；J.Endotheliocyte；K.Blood vessel；L.MDSC.

2 MM的免疫反應

多年來，研究人員幾乎只專注于腫瘤細胞，他們認為，破譯這些細胞的生物學特性可能有助于癌癥的治愈。然而，近年來癌癥生物學的研究表明，不僅是腫瘤細胞本身，微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復發(fā)中都發(fā)揮重要作用，有證據(jù)表明，腫瘤微環(huán)境中殘留的免疫細胞功能失調(diào)可導致宿主抗腫瘤免疫功能受到抑制，在正常的微環(huán)境中，效應細胞能夠產(chǎn)生強大的抗腫瘤反應。然而，腫瘤細胞往往通過抑制其周圍微環(huán)境的抗腫瘤免疫來保護自身免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[15,16]。

與實體腫瘤相似，MM細胞調(diào)節(jié)骨髓微環(huán)境中的免疫分子，使其適應骨髓瘤自身的生長。腫瘤進展過程中的主要免疫抑制機制包括：①調(diào)節(jié)免疫細胞的擴增[如骨髓源性抑制細胞(MDSCs)]；②抗原提呈細胞(APCs)功能障礙；③免疫效應細胞(效應T細胞，NK細胞)的抑制[17,18]。

2.1骨髓源性抑制細胞的雙向調(diào)節(jié)作用 在MM患者的微環(huán)境中，MDSCs的增加對于腫瘤進展具有雙向作用，一方面誘導免疫抑制，另一方面通過分泌細胞因子和生長因子促進腫瘤細胞生長[19]。MDSCs通過信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄因子(STAT3)活化促進免疫逃逸、血管生成、耐藥和轉(zhuǎn)移[20]。然而，其在骨髓中的作用及主要的位點尚不明確。骨髓微環(huán)境保護MM細胞抵抗化學藥物的損傷以及來自宿主免疫系統(tǒng)的攻擊。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在骨髓瘤患者體內(nèi)MDSCs和Tregs明顯增加，這些細胞的水平與疾病的發(fā)展階段和臨床療效有關[21]。MDSCs由不成熟的粒細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞的前體組成，通過抑制適應性免疫應答來促進腫瘤生長，并使CD4和CD8介導細胞免疫應答受到抑制[22]。這些細胞分泌精氨酸酶以消耗微環(huán)境中的精氨酸，導致用于活化T細胞的精氨酸減少。此外，MDSCs通過亞硝基化和活性氧(ROS)的釋放抑制T細胞受體，引發(fā)腫瘤免疫逃逸[23]。

2.2APCs的功能 樹突狀細胞(DC)是體內(nèi)最重要的抗原提呈細胞，在機體抗腫瘤免疫等過程中發(fā)揮重要作用，DC能捕獲、提呈腫瘤抗原并激活初始型T細胞，從而引發(fā)一系列的腫瘤抗原特異性的免疫應答[24]。骨髓不僅是一個原發(fā)性淋巴器官，同時也是一個次級淋巴器官，T細胞在骨髓中發(fā)生反應。成熟DC上調(diào)其細胞膜上共刺激分子CD86、CD80、CD83和CD40表達，這些活化的DC共刺激分子與T細胞膜上的同源CD28結(jié)合，從而引發(fā)DC分泌IL-6、IL-12、TNF-α、IL-1β或IL-10等細胞因子，誘導T細胞分化成不同類型的效應T細胞，啟動適應性免疫應答。DC及其產(chǎn)生的細胞因子在調(diào)節(jié)促炎/抗炎和Th1/Th2反應中起關鍵作用[25]。研究表明，未成熟DC和半成熟DC均能引起T細胞無能或T細胞衰竭，誘導免疫耐受，促進腫瘤發(fā)生。而成熟DC激活免疫反應，發(fā)揮介導抗腫瘤免疫反應的作用[26]。類漿細胞樣樹突狀細胞(pDCs)是DCs的另一個主要分支，也參與骨髓瘤的病理過程。pDCs通過分泌Ⅰ型IFN和IL-6對正常漿細胞的產(chǎn)生和抗體應答起關鍵作用[27]。Chauhan等[28]發(fā)現(xiàn)MM患者骨髓pDCs的數(shù)量和頻率增加，且pDCs可促進骨髓瘤細胞的生長、存活、趨化和耐藥。提示DC的功能直接影響機體的抗腫瘤效應。

巨噬細胞是先天免疫細胞，在宿主自身防御和維持組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。巨噬細胞可塑性強，可根據(jù)周圍環(huán)境改變表型?；罨木奘杉毎话惴譃?類：一類是經(jīng)典的M1型巨噬細胞，另一類是M2型巨噬細胞。M1巨噬細胞主要由IFN-γ,TNF-α和IL-12誘導，參與抗原遞呈并對腫瘤細胞產(chǎn)生細胞毒性作用。且M1型巨噬細胞產(chǎn)生高水平的MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ類分子，促進腫瘤特異性抗原表達。M2型巨噬細胞由IL-4、IL-10和IL-13誘導，支持腫瘤細胞增殖，增強血管生成，形成免疫抑制環(huán)境[29]。未成熟巨噬細胞浸潤到腫瘤微環(huán)境中，隨后被激活，這類巨噬細胞被稱為腫瘤相關巨噬細胞(TAM)。TAMs支持微環(huán)境中腫瘤細胞的生長、存活及血管生成，可降低抗原呈遞能力并抑制T細胞的活化和增殖。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，TAMs通常通過促進癌細胞遷移和侵入，刺激血管生成和抑制抗腫瘤免疫以實現(xiàn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[30]。巨噬細胞在骨髓小室中通過細胞與細胞之間接觸依賴的行為和非接觸性介導的機制維持骨髓瘤細胞生長，同時增強間充質(zhì)干細胞對腫瘤細胞的保護作用。作為骨髓微環(huán)境的重要組成部分，通過巨噬細胞與腫瘤細胞活化信號通路之間的聯(lián)系，可抑制蛋白酶通路阻擋藥物誘導的凋亡[31]。

2.3免疫效應細胞的抑制作用 與健康人相比，MM患者外周血中CD4+/CD8+T細胞比例下降，而骨髓中CD4+/CD8+T細胞比例無明顯改變，外周血CD4+T細胞比例降低與患者臨床表現(xiàn)差相關[32]。腫瘤特異性CD4+T細胞不能直接識別MHC-Ⅱ陰性的腫瘤細胞，而是通過與腫瘤浸潤的巨噬細胞結(jié)合，間接識別MHC-Ⅱ陰性的骨髓瘤細胞[33]。CD4+T提高宿主ACP活化內(nèi)源性CD8+T細胞的能力，CD4+和CD8+T細胞共同產(chǎn)生的IFN-γ刺激先天性和適應性免疫應答。多項研究顯示，Tregs作為T細胞的一種亞型，在多種實體腫瘤中表達升高，在包括MM的血液惡性腫瘤[12,14,31，34]。Tregs分泌的TGF-β和IL-10參與損傷的發(fā)生，來自腫瘤相關性宿主的Tregs有改變腫瘤抑制的能力[35]。同時，Tregs在微環(huán)境中產(chǎn)生高水平的IL-10，抑制DC功能，ICOS-Foxp3+Tregs通過TGF-β抑制T細胞功能。Tregs在癌癥中的積累提示預后不良[36]。免疫效應細胞的抑制可促進腫瘤生長，阻礙腫瘤治療。

NK細胞是固有淋巴細胞(ILC)，能識別并快速清除感染或轉(zhuǎn)化的異常細胞，在腫瘤免疫監(jiān)視中起重要作用[37]。NK細胞除了能釋放溶菌素(Pfp)和顆粒酶(Grz)直接識別裂解腫瘤細胞外還能通過分泌多種細胞因子間接抗腫瘤。然而，盡管NK細胞可以在無刺激的情況下自然殺傷靶細胞，并維持抑制信號和活化信號間的平衡，但在腫瘤背景下，這種平衡被多種機制打破。首先，腫瘤細胞可使活化受體下調(diào)，同時上調(diào)NK細胞抑制受體。然而，腫瘤細胞激活受體的配體低表達，抑制受體的配體高表達，最終，細胞因子及ROS在微環(huán)境中的釋放干擾了NK細胞及DCs的抗癌作用,增強腫瘤的免疫逃逸[38]。此外，細胞毒實驗發(fā)現(xiàn)，外周血NK細胞的下降與臨床晚期乳酸脫氫酶(LDH)水平升高、骨髓漿細胞浸潤及β-2微球蛋白水平顯著相關。NK細胞分泌大量的細胞因子和趨化因子，其中IFN-γ具有潛在的抗腫瘤活性，但其對MM的影響仍需進一步研究[39]。

3 多發(fā)性骨髓瘤的免疫治療

MM的治療方法包括初始治療、自體干細胞移植及鞏固/維持治療和復發(fā)的治療。目前，臨床多采用化療方式治療，當患者完全緩解后考慮骨髓移植。在過去的十幾年中，新一代蛋白酶體抑制劑和免疫調(diào)節(jié)劑的出現(xiàn)改變了該病的格局，但MM仍不能治愈[40]。下文將對幾種基于免疫的治療方法進行簡單綜述，主要包括單克隆抗體，免疫檢查點抑制以及CAR-T療法。

3.1單克隆抗體 單克隆抗體已成為骨髓瘤治療的一個重要組成部分，無論是單一用藥還是與其他生物治療相結(jié)合，都表現(xiàn)出較好的療效。單克隆抗體通常針對腫瘤上的一種抗原或受體位點及一種特定的酶或蛋白質(zhì)，靶向骨髓微環(huán)境，中和生長因子，抑制血管生成，增強宿主抗腫瘤免疫應答。本綜述主要介紹兩種已取得較好臨床療效的單克隆抗體：埃羅妥珠單抗(Elotuzumab)和達雷木單抗(Daratumumab)。2007年，一項臨床前研究發(fā)現(xiàn)，Elotuzumab可抑制MM細胞與骨髓基質(zhì)細胞間的配體阻斷誘導增殖的途徑，并對惡性漿細胞產(chǎn)生抗體依賴性細胞毒性[41]。有研究發(fā)現(xiàn)，Elotuzumab與地塞米松聯(lián)合用藥與地塞米松單用藥相比，總有效率提高13%；與來那度胺聯(lián)合應用效果更佳，總有效率達82%[42，43]。提示Elotuzumab是一種安全具有效的抗MM治療方案，尤其是與標準方案聯(lián)合使用，可以改善療效和預后。

Daratumumab是一種針對人類IgG1k的單克隆抗體，CD38是重要免疫治療靶點，Daratumumab與CD38這一靶點結(jié)合，通過細胞毒性以及抗體介導的吞噬和凋亡誘導，促進MM細胞的死亡[44]。報道有顯示，來那度胺和地塞米松組的客觀緩解率(ORR)為76.4% (P<0.001)，而Daratumumab、來那度胺和地塞米松組的ORR為92.9%；Daratumumab組的部分緩解率(PR)和完全緩解率(CR)均顯著高于對照組(P<0.001)。值得注意的是，Daratumumab組25%的患者沒有微小殘留疾病(MRD)，提示聯(lián)合使用Daratumumab可以產(chǎn)生更好的效果[45]。

3.2免疫檢查點抑制 PD-1/PD-L1是一種負性共刺激分子，PD-1與其配體相互作用導致Th1細胞因子分泌減少，抑制T細胞增殖，促進T細胞凋亡，抑制細胞毒性T細胞介導的殺傷,癌細胞利用該系統(tǒng)創(chuàng)造一個免疫抑制的環(huán)境，促進免疫耐受和疾病進展[46，47]。靶向抑制免疫檢查點可增強T細胞活性，促進抗腫瘤免疫反應。PD-1作為Ⅰ型跨膜蛋白表達在活化T細胞表面，與其配體PD-L1和PD-L2相互作用，實現(xiàn)免疫檢查點抑制抗腫瘤免疫。抑制劑靶向PD-1及其配體(PD-L1或B7H1)在臨床試驗中表現(xiàn)出顯著功效。Gorgun等[48]的研究也證明PD-1/PD-L1阻斷誘導抗MM免疫應答。并且，來那度胺可進一步增強效應細胞介導的細胞毒性，為臨床評估聯(lián)合治療提供框架[49]。

3.3CAR-T療法 嵌合抗原受體(CAR)工程化T細胞是患者自身的T淋巴細胞被基因重組，編碼出一種結(jié)合腫瘤抗原的合成受體，使T細胞能夠識別并殺死表達抗原的癌細胞。CAR分子是一種融合蛋白,其胞外片段是根據(jù)抗原篩選出的抗體序列所衍生的單鏈可變區(qū)(single chain variable fragment,scFv),而胞內(nèi)信號區(qū)能啟動T細胞激活信號和其他下游效應。CAR目前分為4代:第一代CAR的細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域僅含有CD3ζ鏈;第二代含有CD3ζ鏈和共刺激分子,如CD28、4-1BB、CD134(OX40)或者ICOS;第三 代CAR分子在第二代的分子基礎結(jié)構(gòu)上增加了兩個共刺激結(jié)構(gòu)域(CD28或4-1BB等),以增強CAR-T的活力和持久力;第四代CAR則加入了細胞因子或共刺激配體,以期提高CAR-T細胞對腫瘤的浸潤能力并抵抗來自腫瘤微環(huán)境的抑制作用[50]。Shah等[14]于2017年12月報告病人體內(nèi)輸注抗BCMA CAR-T細胞后，患者血液中檢測到CAR-T細胞擴增，ORR為94%。此外，Garfall等[51]發(fā)現(xiàn)復發(fā)/難治性MM患者在接受高劑量melphalan+auto-SCT治療后行抗CD19 CAR-T細胞治療與先前的自體SCT相比,患者反應效果顯著?？笴D19 CAR-T細胞目前正在與抗BCMA CAR-T細胞聯(lián)合進行臨床試驗[52]。除此之外，截至2018年12月，一些探索治療MM其他靶點的CAR試驗已經(jīng)開始,包括CD38(NCT03464916)、CD138(NCT01886976、NCT03672318)、Kappa輕鏈(NCT00881920)和SLAMF7(NCT03710421)[53]。

4 總結(jié)與展望

目前對于MM細胞和骨髓微環(huán)境關系的研究主要集中于細胞與細胞、細胞與基質(zhì)之間的聯(lián)系，以及生長因子、細胞因子等方面。早期研究建立了骨髓微環(huán)境在MM病理過程中的作用，但微環(huán)境的免疫成分還沒有得到足夠的重視，免疫反應是一個動態(tài)的復雜過程，微環(huán)境中的不同成分互相平衡并保護宿主，了解促成MM中的免疫抑制環(huán)境的主要因素是至關重要的目標。在未來，單克隆抗體、檢查點抑制劑、工程化T細胞、蛋白酶體抑制劑及腫瘤疫苗有望成為改善臨床結(jié)果的常規(guī)選擇。即便如此，復發(fā)和耐藥仍不可避免。因此，充分利用微環(huán)境中的免疫成分，探索藥物的聯(lián)合應用，實現(xiàn)對MM的精準治療仍是一個需要攻克的難題。