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        氯氨酮通過抑制炎癥因子表達保護膿毒癥大鼠心肌細胞功能①

        2020-12-25 00:29:56萬永靈
        中國免疫學(xué)雜志 2020年20期
        關(guān)鍵詞:氯胺酮膿毒癥心肌細胞

        劉 宇 李 耀 萬永靈

        (四川省人民醫(yī)院麻醉科,成都610031)

        膿毒癥是一種因患者全身出現(xiàn)的惡性炎癥反應(yīng),主要由于各種感染、創(chuàng)傷、外科手術(shù)等反復(fù)刺激導(dǎo)致機體產(chǎn)生大量炎癥因子產(chǎn)生的疾病,患者病情多變且不穩(wěn)定,容易合并急性腎損傷(acute kidney injury,AKI)或心肌細胞凋亡等,隨著病情的發(fā)展可能會出現(xiàn)多器官功能衰竭[1,2]。氯氨酮又稱凱他敏、鹽酸氯胺酮,是一種靜脈全麻藥[3,4]。目前主要用于各種小手術(shù)或診斷操作時的麻醉,研究表明,氯氨酮與大鼠心肌缺血再灌注時心肌細胞凋亡密切相關(guān)[5]。本文旨在探究氯氨酮對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡、免疫功能紊亂及Bax、Bcl-2表達的影響,以期了解氯氨酮對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡、免疫功能紊亂以及Bax、Bcl-2表達的作用機制,為膿毒癥患者的治療提供一定的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1動物 SPF級3周齡SD大鼠75只,購自廣東醫(yī)學(xué)院實驗動物中心,合格證號:粵監(jiān)證字 2004A029,于15個籠中飼養(yǎng),5只/籠。所有大鼠均在本院動物中心實驗室飼養(yǎng)。

        1.1.2藥物與試劑 蘇木素、伊紅購自武漢博士德生物有限公司;中性福爾馬林、酒精、二甲苯購自天津科密歐有限公司;IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α試劑盒購自美國Sigma 公司;肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB),肌紅蛋白(Myoglobin,Mb) 和肌酸激酶(creatine kinase,CK)試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司;Bcl-2、Bax抗體購自北京傲銳東源生物科技有限公司;Caspase-3抗體購自武漢華聯(lián)科有限公司;TRIzol 試劑購自Thermo Fisher公司;SYBR PCR Master Mix試劑盒購自日本TOYOBO公司。

        1.1.3儀器 TDL-5 型臺式離心機購自上海安亭科學(xué)儀器廠;光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司;切片機購自德國Leica公司;蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司;BS-124s 型電子天平購自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司。

        1.2方法

        1.2.1建立模型 將75只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng) 1 周,隨機選15只為正常對照組,其余60只大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)法建立中度膿毒癥模型,制作方法及判斷模型是否成功參考文獻[6]。具體操作如下:戊巴比妥鈉麻醉大鼠,沿腹做切口,取出大鼠盲腸后線結(jié)扎50%近端盲腸,并使用18號針頭穿孔盲腸2次,兩針孔相距約2 mm,擠出少量糞便后將其放回腹腔,逐層關(guān)腹,消毒。

        1.2.2分組及藥物干預(yù) 將75只大鼠隨機平均分為5組,每組15只,分別為:空白對照組(Control)、誘導(dǎo)模型組(CLP)、低濃度氯胺酮組(Ketamine 10 mg/kg)、中濃度氯胺酮組(Ketamine 20 mg/kg)、高濃度氯胺酮組(Ketamine 40 mg/kg)。氯胺酮處理的各組大鼠分別在模型制備成功后15 min按照上述濃度肌肉注射氯胺酮,空白對照組和誘導(dǎo)模型組分別注射等量生理鹽水,氯胺酮處理4 h后處死大鼠。

        1.2.3HE染色觀察大鼠心臟的病理損傷情況 多聚甲醛固定大鼠組織后石蠟保存,制成組織切片,使用不同體積分數(shù)的乙醇梯度入水,PBS浸洗后浸入蘇木素染色3~5 min,水洗,再使用酸水和氨水分別浸潤、水洗;最后置于伊紅染色2 min,洗去多余染液,濾紙吸干,迅速滴加適量中性樹膠,蓋玻片封固,顯微鏡下觀察染色情況并分析。

        1.2.4ELISA 從大鼠頸總動脈插管接取0.5 ml血液,分別按IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、CK-MB、Mb和CK的試劑盒說明書檢測大鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-10、CK-MB、Mb和CK含量。

        1.2.5Western blot 取大鼠心臟組織提取總蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各自需要檢測蛋白的一抗、二抗,孵育2 h,TBS洗凈,以GAPDH為內(nèi)參蛋白,顯色液顯色后檢測吸光度,計算各蛋白相對表達量。

        1.2.6免疫組化 對石蠟切片進行常規(guī)脫蠟,過氧化氫甲醇液室溫浸泡15 min并使用胃蛋白酶消化,滴加一抗,Caspase-3置于濕盒中恒溫冰箱保存過夜,PBS清洗后滴加二抗,37℃孵育60 min后PBS清洗,顯色后蘇木素復(fù)染1 min脫水并封片,光學(xué)顯微鏡下觀察。

        1.2.7RT-PCR TRIzol試劑提取各組細胞總RNA,測定RNA濃度和純度后,反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,PCR擴增,SYBR PCR Master Mix試劑盒檢測Bax和Bcl-2表達水平,以GAPDH為內(nèi)參。

        1.3統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析和作圖分別采用SPSS 22.0和GraphPad Prism5軟件,方差分析使用單因素方差分析,當(dāng)組間差異存在統(tǒng)計學(xué)意義時,采用SNK方法進行進一步比較;以P<0.05為數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義,本研究所有檢驗均為雙側(cè)檢驗。

        2 結(jié)果

        2.1各組大鼠心臟病理損傷觀察結(jié)果 對照組大鼠心肌組織正常,肌外膜完整,可見血管及神經(jīng);心肌纖維完整,肌細胞核大小形態(tài)未見異常,肌纖維縱切面可見周期性明暗相間橫紋,其余未見異常;誘導(dǎo)模型組大鼠心肌的鏡下部分肌纖維彎曲,部分肌紅蛋白溶解,肌細胞核固縮、溶解,肌束膜破裂;低濃度氯胺酮組大鼠心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲,其余未見異常;中、低濃度氯胺酮組大鼠心肌組織基本正常,肌外膜完整,可見血管及神經(jīng);肌束膜包裹肌纖維,肌纖維完整,肌細胞核大小形態(tài)未見異常,肌纖維縱切面可見明暗相間周期性橫紋;高、低濃度氯胺酮組心肌組織少量肌纖維斷裂溶解彎曲,其余未見異常。見圖1。

        2.2各組大鼠血清中心損標(biāo)記物檢測 由圖2可知,相比對照組,誘導(dǎo)模型組大鼠Mb、CK、CK-MB水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相比誘導(dǎo)模型組,氯胺酮處理各組大鼠Mb、CK、CK-MB水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。

        2.3各組大鼠心肌組織Caspase-3表達 由圖3可知,相比對照組,誘導(dǎo)模型組大鼠Caspase-3蛋白表達水平及Caspase-3陽性細胞百分比顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相比誘導(dǎo)模型組,使用氯胺酮處理各組大鼠Caspase-3蛋白表達水平及Caspase-3陽性細胞百分比顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。

        圖1 各組大鼠心臟病理損傷觀察結(jié)果(×400)Fig.1 Observation results of cardiac pathological dama-ges of rats in each group(×400)

        圖2 各組大鼠血清損傷標(biāo)記物檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of heart damage markers in rats serum of each groupNote: Compared with control,*.P<0.05;compared with CLP group,#.P<0.05.

        圖3 各組大鼠心肌組織Caspase-3表達

        2.4各組大鼠外周血中炎癥因子檢測結(jié)果 由圖4可知,相比對照組,誘導(dǎo)模型組大鼠外周血IL-6、TNF-α、IL-1β水平升高,IL-10水平降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相比誘導(dǎo)模型組,氯胺酮處理各組大鼠外周血IL-6、TNF-α、IL-1β水平降低,IL-10水平升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且呈濃度依賴性。

        圖4 各組大鼠外周血中炎癥因子檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of inflammatory factors in rats peripheral blood of each groupNote: Compared with control,*.P<0.05;compared with CLP group,#.P<0.05.

        圖5 各組大鼠Bax、Bcl-2基因表達檢測結(jié)果Fig.5 Detection results of Bax and Bcl-2 gene expression in rats of each groupNote: 1.Control;2.CLP;3.Ketamine 10 mg/kg;4.Ketamine 20 mg/kg;5.Ketamine 40 mg/kg.Compared with control,*.P<0.05;compared with CLP group,#.P<0.05.

        2.5各組大鼠Bax、Bcl-2基因表達 由圖5可知,相比對照組,誘導(dǎo)模型組大鼠Bax蛋白表達水平及mRNA表達水平升高,Bcl-2蛋白表達水平及mRNA表達水平降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);相比誘導(dǎo)模型組,氯胺酮組大鼠各組大鼠Bax蛋白及mRNA表達降低,Bcl-2蛋白及mRNA表達升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),且變化呈濃度依賴性。

        3 討論

        膿毒癥可加重大鼠體內(nèi)炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的細胞因子主要包括促炎因子和抗炎因子,這兩種因子為拮抗作用。當(dāng)促炎因子水平升高,則體內(nèi)炎癥因子水平降低,表明體內(nèi)炎癥反應(yīng)加??;抗炎因子升高,體內(nèi)炎癥因子受到抑制,則炎癥反應(yīng)減弱[7]。目前研究較多的促炎細胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-6 和IL-8 等[8];抗炎細胞因子則包括IL-4、IL-10、IL-1等[9]。TNF-α可引起心肌細胞產(chǎn)生代謝性應(yīng)激反應(yīng),導(dǎo)致代謝產(chǎn)物增多,促使局部炎癥介質(zhì)大量合成[10]。TNF-α還可作用于中性粒細胞、巨噬細胞,使其廣泛釋放炎癥介質(zhì)從而減少心肌細胞供血,導(dǎo)致心肌細胞缺氧、蛋白聚糖合成能力下降及Ⅰ型和Ⅱ型膠原比例失調(diào)。同時IL-6也可促進組織中MMPs、前列腺素等炎癥物質(zhì)產(chǎn)生和表達,加速炎癥反應(yīng)。IL-1α可增加MMP-3等基質(zhì)金屬蛋白酶降解酶在心肌細胞中的合成和分泌。本研究發(fā)現(xiàn)氯氨酮處理后大鼠外周血炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著降低、抗炎癥因子IL-10水平顯著升高,說明大鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)顯著降低,提示氯氨酮可以通過降低炎癥反應(yīng)保護心肌細胞。隨著氯氨酮處理濃度增加,炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-1β水平顯著降低、抗炎癥因子IL-10水平顯著升高,在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性。黃婷等[11]研究表明,降低炎癥反應(yīng)可保護心肌細胞,與本研究得出的結(jié)論一致。

        目前常見的心肌損傷生物標(biāo)志物主要包括Mb、CK-MB和CK,三者在心肌細胞中含量豐富。周偉梁等[12]和Liebetrau等[13]的研究顯示,當(dāng)心肌細胞受損時,上述蛋白會通過破裂的細胞迅速釋放到細胞,因此可以作為心肌損傷的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,氯氨酮處理后大鼠Mb、CK、CK-MB水平顯著降低,即大鼠心肌細胞受損程度顯著降低。隨著使用氯氨酮處理濃度增加,心肌損傷的生物標(biāo)志物Mb、CK、CK-MB水平逐漸降低,且呈氯氨酮劑量依賴性。沈定榮等[14]研究表明,降低Mb、CK、CK-MB使心肌細胞受損程度顯著降低,與本研究得出的結(jié)論一致。

        膿毒癥除了使大鼠心肌細胞壞死外,還有另外一種細胞死亡形式,即細胞凋亡。細胞凋亡是一種有序或程序性的細胞死亡方式,這種程序性死亡是受相關(guān)基因調(diào)控的細胞主動性死亡過程[15,16]。Caspase是細胞凋亡的核心,Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子[17]。賈曉鵬等[18]通過前列腺腺癌細胞實驗分析得出,Caspase-9基因處于Caspase 家族激活基因的頂端,是Caspase家族中最常見的凋亡啟動子,通過自身的裂解使proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3。這種有活性的Caspase-3是執(zhí)行凋亡的基因,主要作用機理是通過剪切另外的 Caspase 底物引起級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細胞凋亡。細胞凋亡的調(diào)控因子較多,除Caspase家族外,Bcl-2 家族也是常見的凋亡控制基因。Bcl-2 家族主要由Bcl-2和Bax兩種蛋白的表達量決定細胞是否凋亡[19-21]。Bax和Bcl-2表達呈相反趨勢,當(dāng)Bcl-2表達下降時 Bax 表達上升,此時會促進細胞凋亡;當(dāng)Bcl-2表達升高,Bax表達降低時,則會抑制細胞的凋亡。本研究表明,相比模型組,氯氨酮處理大鼠Bax、Caspase-3水平顯著降低、Bcl-2水平顯著升高,說明大鼠心肌細胞凋亡受到顯著抑制,且呈氯氨酮濃度依賴性。陳歡[22]研究表明,氯氨酮可以抑制心肌細胞的凋亡,與本研究的結(jié)論一致。

        綜上所述,氯氨酮可通過調(diào)節(jié)大鼠心肌細胞內(nèi)凋亡因子水平和免疫功能保護膿毒癥大鼠心肌細胞,且在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性,其作用機制可能與降低心肌細胞內(nèi)凋亡因子和促炎因子水平、升高抗凋亡因子和抗炎因子水平有關(guān)。但本研究的心肌細胞凋亡指標(biāo)較少,在后續(xù)的實驗中,將使用流式細胞術(shù)等方法進一步探討氯氨酮對膿毒癥大鼠心肌細胞凋亡機制。

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