（福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建省立醫(yī)院老年科，福建省臨床老年病研究所，福州 350001）

根據(jù)國際糖尿病協(xié)會(huì)的報(bào)告，2017年全球有4.25億糖尿病患者，其中2型糖尿病占90%以上。有研究［1］預(yù)測(cè)2045年糖尿病患者數(shù)量將增至6.29億。糖尿病常導(dǎo)致全身血管及神經(jīng)并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制尚不明確。因此，從基因水平闡明2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制對(duì)于預(yù)防和治療有重要意義。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)分析成為深入了解2型糖尿病的一種新工具?；虮磉_(dá)匯編（gene expression omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫存儲(chǔ)許多表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)。有學(xué)者通過單個(gè)數(shù)據(jù)集對(duì)糖尿病患者和健康人群血液中的差異基因進(jìn)行了研究［2-3］，然而，國內(nèi)尚未有使用R語言通過去除批次間差異的方式對(duì)單個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行聯(lián)合分析的報(bào)道。另外，糖尿病和阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）關(guān)系密切［4］，本研究將GEO數(shù)據(jù)庫中2個(gè)人類2型糖尿病數(shù)據(jù)集進(jìn)行聯(lián)合分析，探索糖尿病發(fā)病的分子機(jī)制；同時(shí)利用基因集富集分析（gene-set enrichment analysis，GSEA）分析2型糖尿病關(guān)鍵基因與AD的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載芯片GSE85192（平臺(tái)GPL16956）、GSE95849（平臺(tái)GPL22448）、GSE97760（平臺(tái)GPL16699）、GSE85426（平臺(tái)GPL14500）。GSE95849中納入12份樣品，其中6份為2型糖尿病不伴糖尿病周圍神經(jīng)病變患者，6份為健康者。GSE85192中納入18份樣品，其中12份為治療前的2型糖尿病患者，6份為健康者。GSE97760中納入19份樣品。其中10份非AD患者，9份為AD患者。GSE85426中納入180份樣品，其中90份為AD患者，90份為正常對(duì)照組。以上樣本均來自外周血。下載芯片中的矩陣文件和平臺(tái)文件。

1.2 方法

1.2.1 矩陣注釋：運(yùn)用Perl軟件（版本 5.30.1）對(duì)GSE95849、GSE97760、GSE85426 3個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行處理，利用平臺(tái)文件中的基因名將原始矩陣文件ID重注釋為基因名。對(duì)于GSE85192數(shù)據(jù)集，從Gencode數(shù)據(jù)庫（ftp：//ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/）下載人類轉(zhuǎn)錄本序列文件。使用BLAST軟件將人類轉(zhuǎn)錄本序列與矩陣中探針核酸序列比對(duì)，得到含有基因名的重注釋平臺(tái)文件［5］。

1.2.2 多芯片矩陣合并及批次校正：將矩陣探針表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og2 轉(zhuǎn)化后，使用Perl軟件將GSE95849、GSE85192 2個(gè)數(shù)據(jù)集的表達(dá)矩陣合并為1個(gè)矩陣。使用R軟件（版本3.6.2）的sva包（sva包能使用對(duì)照探針消除批次間效應(yīng)，還能直接構(gòu)建新的替代變量用于分析，去除批間差［6］）進(jìn)行批次校正。

1.2.3 差異分析：使用R軟件的limma包分析矩陣中的差異基因，以基因表達(dá)量log2差異倍數(shù)（log2 fold change，logFC）＞0.5或者＜-0.5，并且校正后P值＜0.05為篩選參數(shù)，得到差異基因。用R軟件繪制差異基因聚類熱圖。

1.2.4 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）：利用R軟件的WGCNA包，輸入差異基因的表達(dá)矩陣，設(shè)置閾值為0.6，根據(jù)基因表達(dá)相似性，將基因劃分成不同的模塊，計(jì)算每個(gè)模塊與2型糖尿病、年齡、性別3種臨床性狀的Pearson相關(guān)系數(shù)及P值，選取P＜0.01的模塊內(nèi)的基因用于后續(xù)分析。

1.2.5 基因功能注釋和信號(hào)通路分析：將與2型糖尿病相關(guān)模塊中的基因輸入 DAVID6.8（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能分析，主要分析生物過程（biological process，BP）。再利用京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）工具對(duì)這些基因進(jìn)行分析，以P＜0.05同時(shí)伴通路所含基因數(shù)＞4個(gè)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，按P值從小到大篩選前10條項(xiàng)目。

1.2.6 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與模塊分析：使用STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）分析差異基因編碼蛋白的相互作用。再將得到的蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)輸入 Cytoscape 軟件（版本3.7.2），使用 cytoHubba 插件進(jìn)行分析。

1.2.7 GSEA：Toll樣受體4（Toll-like receptor，TLR4）基因是關(guān)鍵基因，在GSE97760中AD患者和非AD患者間的表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（校正后P＜0.05），且在AD中高表達(dá)，因此對(duì)GSE97760矩陣中TLR4的表達(dá)量從小到大進(jìn)行排序，以前10個(gè)為低表達(dá)組，后9個(gè)為高表達(dá)組，分析與TLR4高表達(dá)相關(guān)的信號(hào)通路。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.8TLR4表達(dá)量驗(yàn)證：獲得GSE85426中各樣本中TLR4的表達(dá)量，對(duì)正常組和AD組的表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn)，用R語言繪制箱圖使結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 2型糖尿病患者差異表達(dá)的基因

結(jié)果顯示，與健康組比較，2型糖尿病組共獲得626個(gè)差異表達(dá)基因，其中336個(gè)上調(diào)，290個(gè)下調(diào)。前100個(gè)（校正后P值從小到大排序）差異基因見圖1。

2.2 WGCNA結(jié)果

圖1 差異表達(dá)基因分層聚類樹形圖和熱圖Fig.1 Tree and heat map showing hierarchical clustering of differentially expressed genes

將得到的差異基因輸入WGCNA后，得到3個(gè)共表達(dá)基因模塊，見圖2。結(jié)果顯示，灰色和綠色模塊內(nèi)基因與2型糖尿病有關(guān)（P＜0.01）；2個(gè)模塊中共有567個(gè)基因。3個(gè)模塊中基因與年齡、性別均無關(guān)（P＞0.01），見圖3。

2.3 GO分析結(jié)果

結(jié)果顯示，差異基因主要參與的生物過程包括炎癥反應(yīng)，細(xì)胞對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)，Toll樣受體（Tolllike receptor，TLR）信號(hào)通路，趨化因子、β干擾素產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)，組蛋白脫乙酰化等，見圖4。

圖2 基因聚類樹狀圖Fig.2 Gene clustering dendrogram

圖3 臨床特征與模塊特征相關(guān)性熱圖Fig.3 Heat map showing the correlation between clinical features and module features

2.4 KEGG分析結(jié)果

差異基因主要參與的KEGG信號(hào)通路有嘧啶代謝通路、TLR信號(hào)通路、瘧疾、麻疹、RNA降解，見圖5。

2.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及模塊分析結(jié)果

共有567個(gè)mRNA輸入STRING數(shù)據(jù)庫，以置信度得分＞0.4為篩選參數(shù)，除外孤立的蛋白，共得到1 686對(duì)蛋白互作關(guān)系，470個(gè)蛋白。使用cytoHubba 插件，按照度值和強(qiáng)度得分選取前10個(gè)基因，見表1、2。之后取交集，最終得到的關(guān)鍵基因?yàn)镮LF2、TLR4、POLR2G、MMP9。

2.6 GSEA分析結(jié)果

在GSE97760中，與TLR4高表達(dá)相關(guān)的KEGG通路富集于半胱氨酸和蛋氨酸代謝、基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞周期、TLR信號(hào)通路、嘧啶代謝信號(hào)通路等（P＜0.05），見圖6A～6E。

圖4 差異基因參與的生物學(xué)過程Fig.4 Biological processes involved in differential genes

圖5 差異基因參與的KEGG通路Fig.5 KEGG pathways involved in differential genes

表1 關(guān)鍵基因篩選（按照度值排序）Tab.1 Hub gene screening by degree

表2 關(guān)鍵基因篩選（按照強(qiáng)度排序）Tab.2 Hub gene screening by stress

2.7 TLR4表達(dá)量驗(yàn)證

結(jié)果顯示，在GSE85426中，正常人和AD患者外周血中的校正后TLR4水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖6F。

3 討論

生物學(xué)過程顯示，外周血中2型糖尿病患者與健康人差異基因的生物學(xué)功能富集在TLR信號(hào)通路、趨化因子產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、β干擾素產(chǎn)生的正向調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)，而且四者之間存在密切聯(lián)系。TLR信號(hào)通路激活后，可以通過趨化因子和β干擾素產(chǎn)生2種途徑誘導(dǎo)全身慢性炎癥反應(yīng)，進(jìn)而引起胰島素抵抗。研究［7］顯示高脂飲食會(huì)導(dǎo)致腸道通透性增加，使脂多糖從腸道進(jìn)入血液。脂多糖可以激活TLR4并與免疫細(xì)胞表面的CD14結(jié)合，觸發(fā)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生和趨化因子介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞募集，引起胰島素抵抗，并導(dǎo)致低強(qiáng)度全身性炎癥。炎性細(xì)胞因子還能使巨噬細(xì)胞在脂肪組織中募集，促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放促炎性細(xì)胞因子［8］，從而干擾組織中的胰島素信號(hào)，促進(jìn)2型糖尿病發(fā)生［9］。還有學(xué)者［10-11］發(fā)現(xiàn)TLR3也能激活TLR信號(hào)通路，通過誘導(dǎo)β干擾素等激活Ⅰ型β干擾素，加速胰島β細(xì)胞功能障礙和凋亡。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)［12］證實(shí)β干擾素突變小鼠就不會(huì)有TLR3介導(dǎo)的胰島炎癥反應(yīng)。因此根據(jù)富集分析結(jié)果，可能存在“TLR-β干擾素/趨化因子-胰島炎癥反應(yīng)軸”，這可能是導(dǎo)致2型糖尿病的重要原因之一。

KEGG通路顯示，差異基因富集在嘧啶代謝、TLR信號(hào)通路、瘧疾、麻疹、RNA降解上。有學(xué)者［13］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)與2型糖尿病相關(guān)的診斷標(biāo)志物進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠體內(nèi)核苷酸（包括嘧啶）水平較低，提示嘧啶代謝途徑受到干擾。有學(xué)者［14］分析了糖尿病腎病大鼠和正常大鼠之間的代謝差異，發(fā)現(xiàn)差異富集在嘧啶代謝等代謝途徑上，說明糖尿病腎病小鼠中存在嘧啶代謝紊亂。

本研究對(duì)關(guān)鍵基因的分析結(jié)果顯示，TLR4、POLR2G、MMP9、ILF2可能是2型糖尿病發(fā)生的關(guān)鍵基因。糖尿病通過血管、葡萄糖代謝改變導(dǎo)致神經(jīng)變性。AD通過下丘腦功能障礙、衰弱等影響全身葡萄糖代謝［15］。通過GSEA分析發(fā)現(xiàn)在AD患者中，TLR4升高也與嘧啶代謝和TLR信號(hào)通路有關(guān)，兩者同時(shí)在2型糖尿病發(fā)生中起作用，可能是AD和2型糖尿病共同的發(fā)病機(jī)制。嘧啶是腦磷脂酰膽堿合成的原料。用尿嘧啶核苷源的飼料灌胃，可使沙土鼠腦磷脂酰膽堿增加，軸突神經(jīng)突觸膜的數(shù)量增加［16］。有學(xué)者［17］對(duì)AD模型小鼠海馬進(jìn)行分析，結(jié)果顯示小鼠海馬尿嘧啶明顯增加，這可能是由于AD磷脂酰膽堿的合成減少而分解增多所致。AD可以表現(xiàn)為嘧啶代謝異常，但嘧啶代謝異常是否也是AD的病因尚待進(jìn)一步驗(yàn)證。近年研究［18-20］發(fā)現(xiàn)，TLR通過識(shí)別病原體并啟動(dòng)炎癥過程，在大腦中，尤其是在小膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了TLR。腸道菌群與腸道和大腦（菌群-腸-腦軸）相互作用是引起AD的機(jī)制之一。腸道菌群失調(diào)可激活大腦中TLR信號(hào)通路，加重炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致AD發(fā)生。因此，TLR4可能是2型糖尿病與AD之間的潛在聯(lián)系。

圖6 TLR4高表達(dá)有關(guān)的KEGG通路Fig.6 Analysis of KEGG pathways related to high expression of TLR4

綜上所述，2型糖尿病發(fā)生可能與TLR-干擾素β/趨化因子-胰島炎癥反應(yīng)軸密切相關(guān)。ILF2、TLR4、POLR2G、MMP9為2型糖尿病發(fā)病的關(guān)鍵基因，TLR4上調(diào)可通過影響嘧啶代謝及TLR信號(hào)通路影響2型糖尿病及AD的發(fā)生。本研究不足之處在于GSE95849數(shù)據(jù)集選取的對(duì)象為女性糖尿病患者，可能影響差異基因的分析結(jié)果，將來如果有更多的糖尿病外周血轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以將組間性別、年齡等基線資料進(jìn)行匹配后再進(jìn)行分析，進(jìn)而提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。