關(guān)國欣，王冰，黃寶俊，趙丹懿

（1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院急腹癥外科，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科，遼寧 大連 116027；3.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科，沈陽 110001）

胃癌在我國發(fā)病率僅次于肺癌，近年來胃癌的發(fā)病率和死亡率逐年上升［1-2］?；瘜W(xué)治療（簡稱化療）是治療腫瘤最有效的方法之一。中國臨床腫瘤學(xué)會(huì)對(duì)胃癌的一線治療方案為氟尿嘧啶和鉑類藥物的聯(lián)合治療，如順鉑（cisplatin，CDDP）聯(lián)合5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）。化療能明顯改善胃癌患者的預(yù)后，但化療耐藥嚴(yán)重限制了化療的臨床應(yīng)用。因此，研究并發(fā)現(xiàn)提高化療敏感性的方法尤為重要。

許多非編碼RNA被證明參與腫瘤化療耐藥的發(fā)生和維持［3-4］。生長抑制特殊轉(zhuǎn)錄本5（growth arrest specific transcript 5，GAS5）降低膀胱癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性［5］，尿路上皮癌相關(guān)1（urothelial carcinoma associated 1，UCA1）敲除抑制胃癌細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性［6］。?；撬嵘险{(diào)基因1（taurine upregulated gene 1，TUG1）是在視網(wǎng)膜發(fā)育的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)并確定的［7］，其在膀胱癌和膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中存在異常的表達(dá)和功能［8-11］。TUG1在胃癌中高表達(dá)，能作為癌基因發(fā)揮作用，可以作為胃癌潛在的預(yù)后因子［12］。但TUG1在胃癌化療耐藥中的作用尚不清楚。本研究擬探討TUG1與胃癌細(xì)胞對(duì)化療藥物CDDP和5-FU的敏感性的關(guān)系及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：76例胃癌及其癌旁正常組織均取自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腫瘤科的標(biāo)本庫。本研究獲得了大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。胃癌SGC7901細(xì)胞系以及多藥耐藥細(xì)胞系SGC7901/R由中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤外科惠贈(zèng)。本組患者包括男52例，女24例，年齡43～71歲，中位年齡為61.2歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均經(jīng)胃鏡活檢及病理檢測證實(shí)為胃癌，診斷前未接受其他治療，均選擇CDDP和5-FU聯(lián)合化療（新輔助化療或姑息化療）作為第一階段的治療方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者病理資料不完整，或者患有其他疾病，包括其他腫瘤。所有患者接受2～4個(gè)療程的聯(lián)合化療，通過影像學(xué)檢查（增強(qiáng)CT）和胃鏡檢查來判斷治療效果。根據(jù)瘤體大小變化等評(píng)價(jià)治療效果，將患者分為化療敏感組（47例）和化療不敏感組（29例）。

1.1.2 主要試劑：DMEM 高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自北京全式金公司；Trizol和Lipofectamine 3000購自美國賽默飛公司；SYBR RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；Smart Silencer-TUG1（ss-TUG1）及陰性對(duì)照（ss-NC）購自廣州銳博生物公司；增強(qiáng)型CCK8試劑盒購自上海碧云天公司；CDDP和5-FU購自美國Sigma-aldrich公司；pE-CTNNB1質(zhì)粒及空質(zhì)粒（pENC）購自上海吉瑪公司；TOP Flash和FOP Flash熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒購自長沙優(yōu)寶公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京威格拉斯公司；CTNNB1和GAPDH抗體購自云克隆公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：SGC7901和SGC7901/R細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃和5% CO2。將5×104SGC7901/R細(xì)胞接種在6孔板中，培養(yǎng)24 h。應(yīng)用Lipofectamine 3000按照說明書操作，將Smart Silencer和（或）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/R細(xì)胞，培養(yǎng)5～6 h，更換培養(yǎng)基后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR：從組織或細(xì)胞標(biāo)本中提取總RNA，檢測RNA的純度和完整性。以GAPDH為內(nèi)參基因，應(yīng)用SYBR RT-PCR試劑盒擴(kuò)增TUG1基因。引物序列見表1。反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照說明書。應(yīng)用比較CT值法對(duì)TUG1的表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers used in the current study

1.2.3 藥物敏感性檢測：分別用CDDP（0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL）或5-FU（1 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL）處理SGC7901/R細(xì)胞。按照說明書使用增強(qiáng)型CCK8試劑盒檢測細(xì)胞活力。檢測450 nm處的吸光度，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.4 熒光素酶實(shí)驗(yàn)：應(yīng)用Lipofectamine 3000將熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901/R細(xì)胞。采用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶為基線，腎素?zé)晒馑孛笧閮?nèi)控，計(jì)算兩者比值反映Wnt/CTNNB1信號(hào)通路的活性。

1.2.5 Western blotting：提取SGC7901/R細(xì)胞總蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量。取30 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，用脫脂牛乳4 ℃封閉過夜，經(jīng)CTNNB1抗體雜交，二抗孵育，化學(xué)發(fā)光，凝膠成像儀獲取圖像。然后，利用Image J軟件對(duì)圖像中的譜帶進(jìn)行檢測和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，數(shù)據(jù)用表示。組間差異采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，2組獨(dú)立樣本均值比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TUG1的高表達(dá)與化療敏感性相關(guān)

胃癌組織表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)，TUG1在不敏感組胃癌組織中的的表達(dá)明顯高于其在敏感組中的表達(dá)（圖1A，P＜0.05）。

藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，SGC7901和SGC7901/R細(xì)胞CDDP的IC50分別為（1.83±0.23）μg/mL和（9.17±0.89）μg/mL，耐藥指數(shù)（resistance index，RI）為5.01（圖1B，P＜0.05）；SGC7901和SGC7901/R細(xì)胞5-FU的IC50分別為（5.23±0.48）μg/mL和（30.62±2.78）μg/mL，RI為5.85（圖1C，P＜0.05）。SGC7901/R細(xì)胞對(duì)CDDP和5-FU的敏感性更低，耐藥率更高。與組織表達(dá)檢測結(jié)果相似，TUG1在多藥耐藥的SGC7901/R細(xì)胞中的表達(dá)高于其在親本的SGC7901細(xì)胞中的表達(dá)（圖1D，P＜0.05）。

2.2 TUG1沉默增強(qiáng)SGC7901/R細(xì)胞對(duì)CDDP和5-FU的敏感性

圖1 TUG1的高表達(dá)與胃癌患者的化療不敏感相關(guān)Fig.1 High TUG1 expression is related to chemotherapy insensitivity in GC

將ss-TUG1轉(zhuǎn)染入SGC7901/R細(xì)胞可以顯著降低TUG1的表達(dá)（圖2A，P＜0.05）。藥物敏感性檢測發(fā)現(xiàn)，ss-NC組SGC7901/R細(xì)胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（8.81±0.62）μg/mL和（31.02±2.64）μg/mL，而TUG1沉默組SGC7901/R細(xì)胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（3.57±0.41）μg/mL和（8.42±0.93）μg/mL。TUG1的沉默能提高SGC7901/R細(xì)胞對(duì)CDDP和5-FU的敏感性。

2.3 TUG1沉默失活SGC7901/R細(xì)胞中的Wnt/CTNNB1信號(hào)通路

在腫瘤基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中對(duì)450例胃癌樣本進(jìn)行共表達(dá)分析，結(jié)果顯示，TUG1與CTNNB1呈顯著正相關(guān)（圖3A，r=0.324 9，P＜0.05）。其次，TUG1沉默抑制了SGC7901/R細(xì)胞中的螢火蟲熒光素酶/腎素?zé)晒馑孛笩晒獗戎?，意味著Wnt/CTNNB1信號(hào)通路的活性降低（圖3B，P＜0.05）。此外，TUG1沉默抑制SGC7901/R細(xì)胞CTNNB1蛋白的表達(dá)（圖3C，P＜0.05）。因此，TUG1沉默能夠失活SGC7901/R細(xì)胞中的Wnt/CTNNB1信號(hào)通路。

2.4 Wnt/CTNNB1信號(hào)通路介導(dǎo)TUG1對(duì)SGC7901/R細(xì)胞化療敏感性的調(diào)節(jié)

與ss-TUG1+pE-NC組SGC7901/R細(xì)胞相比，ss-TUG1+pE-CTNNB1組SGC7901/R細(xì)胞的螢火蟲熒光素酶/腎素?zé)晒馑孛笩晒獗戎岛虲TNNB1蛋白表達(dá)均顯著升高（圖4A、4B，P＜0.05）。CTNNB1過表達(dá)能夠激活由于TUG1沉默而失活的Wnt/CTNNB1信號(hào)通路。ss-TUG1+pE-NC組SGC7901/R細(xì)胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（3.44±0.45）μg/mL和（8.21±0.87）μg/mL，ss-TUG1+pE-CTNNB1組SGC7901/R細(xì)胞中CDDP和5-FU的IC50分別為（7.26±0.86）μg/mL和（24.63±2.69）μg/mL（圖4C、4D，P＜0.05）。ss-TUG1+pE-CTNNB1組SGC7901/R細(xì)胞中CDDP和5-FU敏感性明顯低于ss-TUG1+pE-NC組SGC7901/R細(xì)胞。Wnt/CTNNB1信號(hào)通路的激活逆轉(zhuǎn)了TUG1沉默對(duì)SGC7901/R細(xì)胞化療敏感性的促進(jìn)作用。

圖2 TUG1沉默增強(qiáng)SGC7901/R細(xì)胞對(duì)CDDP和5-FU的敏感性Fig.2 TUG1 silencing enhances the sensitivity of SGC7901/R cells to CDDP and 5-FU

圖3 TUG1沉默失活SGC7901/R細(xì)胞中的Wnt/CTNNB1信號(hào)通路Fig.3 TUG1 silencing inactivates the Wnt/CTNNB1 signaling pathway in SGC7901/R cells

3 討論

越來越多的研究表明，非編碼RNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要而復(fù)雜的作用。其中，lncRNAs因其數(shù)量眾多、功能和機(jī)制復(fù)雜等特點(diǎn)，引起了研究者的廣泛關(guān)注。lncRNAs被證明參與了腫瘤細(xì)胞的幾乎所有生物學(xué)行為，包括化療敏感性［13-15］。例如，神經(jīng)母細(xì)胞瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（neuroblastoma associated transcript 1，NBAT1）可以通過miR21/SOCS6途徑抑制膀胱癌細(xì)胞的惡性表型［16］，核富集豐富轉(zhuǎn)錄物1（nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1）作為癌基因促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為和阿霉素抗性［17］。

在本研究中，TUG1在化療耐藥的胃癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，TUG1沉默能夠提高SGC7901/R細(xì)胞對(duì)CDDP和5-FU的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)證實(shí)了TUG1參與了胃癌化療耐藥的形成，但其機(jī)制尚不清楚。

生物信息學(xué)分析為研究TUG1在胃癌化療耐藥中的機(jī)制指明了方向?；赥CGA數(shù)據(jù)庫的共表達(dá)分析證實(shí)TUG1與CTNNB1呈顯著正相關(guān)，而CTNNB1是Wnt/CTNNB1信號(hào)通路的關(guān)鍵分子。此外，TUG1沉默能夠失活SGC7901/R細(xì)胞中的Wnt/CTNNB1信號(hào)通路。Wnt/CTNNB1信號(hào)通路是一種經(jīng)典的、被廣泛研究的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，參與多種細(xì)胞生物學(xué)功能和行為的調(diào)控［18-19］。研究［20-21］表明Wnt/CTNNB1信號(hào)通路在多種腫瘤（包括胃癌）化療耐藥的發(fā)生和維持中起重要作用。MA等［22］報(bào)道TUG1沉默能夠失活肝細(xì)胞癌中的Wnt/CTNNB1信號(hào)通路。

圖4 Wnt/CTNNB1信號(hào)通路介導(dǎo)TUG1對(duì)SGC7901/R細(xì)胞化療敏感性的調(diào)節(jié)Fig.4 Wnt/CTNNB1 signaling pathway mediates the regulation of TUG1 in chemotherapy sensitivity in SGC7901/R cells

據(jù)此推測TUG1能夠通過Wnt/CTNNB1信號(hào)通路參與調(diào)控胃癌的化療耐藥。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，進(jìn)行了一系列的拯救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Wnt/CTNNB1信號(hào)通路的激活逆轉(zhuǎn)了TUG1沉默對(duì)胃癌細(xì)胞化療敏感性的促進(jìn)作用，即Wnt/CTNNB1信號(hào)通路介導(dǎo)了TUG1對(duì)SGC7901/R細(xì)胞化療敏感性的調(diào)節(jié)。然而，TUG1調(diào)控Wnt/CTNNB1信號(hào)通路的機(jī)制尚不清楚。

綜上所述，TUG1與胃癌患者對(duì)CDDP和5-FU的化療不敏感有關(guān)，TUG1沉默通過Wnt/CTNNB1信號(hào)通路促進(jìn)胃癌的化療敏感性。本研究結(jié)論有助于闡明胃癌的化療耐藥機(jī)制，同時(shí)為胃癌的生物治療提供了新的靶點(diǎn)。