張其琛， 江立波， 李熙雷

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032

隨著老齡化問題逐漸加重，骨科退行性疾病的發(fā)生率逐漸升高，危害日益增加。其中骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)和椎間盤退變成為全球疾病負(fù)擔(dān)中導(dǎo)致失能生存年(years lived with disability, YLD)的最主要疾病[1]。

為減少手術(shù)等傳統(tǒng)治療方法對(duì)患者造成的身心負(fù)擔(dān)，研究者從分子醫(yī)學(xué)和生物工程等方面開展了大量工作。其中干細(xì)胞療法被人們寄予厚望，應(yīng)用胚胎干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)、誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell, IPSC)等進(jìn)行軟骨和椎間盤修復(fù)再生的體外和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均取得了良好的結(jié)果[2-4]。

但是，應(yīng)用干細(xì)胞療法具有細(xì)胞泄露、潛在的癌變可能和造成椎間隙和關(guān)節(jié)腔感染的風(fēng)險(xiǎn)[5]。研究[6-7]表明，包括MSC在內(nèi)的多種細(xì)胞來源的外泌體可促進(jìn)軟骨修復(fù)等過程。此外，外泌體還可通過多種生物學(xué)方式參與疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，外泌體逐漸成為退行性疾病方向的一大熱點(diǎn)。本文主要對(duì)不同細(xì)胞來源的外泌體在骨科退行性疾病中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 外泌體的來源和作用

外泌體是一種具有脂膜結(jié)構(gòu)的直徑為30～150 nm的小囊泡，可被多種細(xì)胞分泌，并已在血清、乳汁、精液等多種體液中被發(fā)現(xiàn)。外泌體與微囊泡、凋亡小體同屬細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)。EVs被認(rèn)為是細(xì)胞間交流的重要方式，運(yùn)輸miRNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，而對(duì)接收的細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)[8]。其中，外泌體可通過核內(nèi)體來源的多泡體(multivesicular bodies, MVBs)與胞膜融合并發(fā)生胞吐作用釋放到細(xì)胞外，而微囊泡則直接通過細(xì)胞膜出芽形成[9]。

憑借攜帶的內(nèi)容物和分泌迅速的特性，外泌體不僅可影響受體細(xì)胞的表型、細(xì)胞遷移、增殖，還可通過分泌出多余或有害的蛋白、脂質(zhì)、核酸維持親代細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)[10]。外泌體攜帶的蛋白質(zhì)包括源細(xì)胞非特異性和源細(xì)胞特異性2類蛋白分子，其中前者包括和MVBs生成有關(guān)的Alix、腫瘤易感基因101(TSG101)、熱休克蛋白(Hsp60、Hsp70、Hsp90)和四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)等，而后者則根據(jù)源細(xì)胞類型有所不同。其中CD9、CD63、CD81等表面膜蛋白已作為外泌體識(shí)別和分選的重要標(biāo)志物[11]。

2 MSC來源外泌體在骨科退行性疾病中的作用

盡管MSC來源豐富，但對(duì)臍帶、脂肪組織、骨髓等不同組織來源的MSC的研究[12]發(fā)現(xiàn)，其對(duì)軟骨細(xì)胞的營養(yǎng)作用是相似的。與此觀察結(jié)果相對(duì)應(yīng)，盡管來源不同的MSC外泌體的內(nèi)容物成分各異，卻并不影響其在軟骨再生和修復(fù)中的作用。

由于MSC外泌體的內(nèi)容物成分繁多，其具體參與軟骨再生及修復(fù)的機(jī)制仍未完全清楚。但根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，MSC來源外泌體參與軟骨修復(fù)、再生的機(jī)制主要涉及以下4個(gè)方面。

2.1 生物能量學(xué) MSC來源外泌體的內(nèi)容物中包含豐富的糖酵解ATP，可生成相關(guān)酶類，如磷酸葡糖激酶、丙酮酸激酶等。這類酶可使細(xì)胞中ATP產(chǎn)量升高、糖酵解介導(dǎo)的合成代謝反應(yīng)增強(qiáng)，從而改善OA軟骨細(xì)胞因線粒體功能障礙、ATP不足而導(dǎo)致的軟骨細(xì)胞炎癥、過度凋亡和基質(zhì)分解代謝增強(qiáng)[13-14]。此外，盡管線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生ATP比糖酵解更加高效，OA中軟骨細(xì)胞糖酵解的水平卻提高了10%～100%，足以彌補(bǔ)這種不足。且糖酵解為其他合成步驟提供了代謝中間產(chǎn)物并恢復(fù)了受損細(xì)胞的氧化還原電位，有助于軟骨細(xì)胞的損傷修復(fù)[15]。

2.2 細(xì)胞的增殖與分化 在OA的發(fā)展過程中，由于炎癥反應(yīng)的加劇，關(guān)節(jié)軟骨常伴隨細(xì)胞數(shù)量減少，且失去正常的結(jié)構(gòu)與功能。在軟骨的修復(fù)過程中，間質(zhì)細(xì)胞的增殖和向軟骨細(xì)胞的分化起到了重要作用[16]。而研究[17]顯示，MSC分泌的外泌體可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖而對(duì)關(guān)節(jié)軟骨具有相似的修復(fù)作用。而一系列細(xì)胞增殖與軟骨細(xì)胞分化信號(hào)通路關(guān)鍵分子，如SMAD、AKT和ERK通路等，均受到MSC外泌體中miRNA的密切調(diào)控。因此，MSC外泌體所含的150多種miRNA的作用受到越來越多的關(guān)注[18]。例如，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有誘導(dǎo)骨膜細(xì)胞、MSC向軟骨分化的作用。miR92a可與BMP的拮抗基因noggin3作用，正調(diào)控軟骨生發(fā)層的增殖，從而促進(jìn)人咽軟骨的形成[19]。來自miR92a過表達(dá)的人MSC的外泌體也被證實(shí)可調(diào)控WNT5A的活性，增強(qiáng)軟骨發(fā)生、抑制軟骨基質(zhì)降解[20]。在軟骨形成的早期，WNT5A可激活增殖，抑制軟骨細(xì)胞的分化[21-22]。此外，WNT5A可激活基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，減少軟骨形成后期和成熟軟骨細(xì)胞中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成和合成[23]。而另一項(xiàng)研究[24]顯示，miR23b可下調(diào)人MSC中具有促成骨分化作用的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信號(hào)通路的活性，促進(jìn)人MSC向軟骨細(xì)胞分化。

特異蛋白-1(specificity protein 1，Sp1)是轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和增殖的作用[25-26]。研究者[26]發(fā)現(xiàn)，Sp1可通過調(diào)控小鼠的膠原α1基因，抑制軟骨細(xì)胞的增殖。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)可刺激MSC外泌體中miR-135b的高表達(dá)，并下調(diào)Sp1的表達(dá)，促進(jìn)人軟骨細(xì)胞增殖[27]。

然而，MSC外泌體富含的miRNA中，也有些在軟骨修復(fù)過程中扮演了負(fù)面角色。就如實(shí)驗(yàn)[28]觀察到，miR145在TGF-β3介導(dǎo)的人MSC向軟骨細(xì)胞分化中表達(dá)下降。隨后被證實(shí)其通過抑制軟骨發(fā)生關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子SOX9蛋白水平的表達(dá)而在早期軟骨分化中起到負(fù)面作用。還有一些miRNA則通過調(diào)控降解軟骨分化過程中起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)子的蛋白酶的活性間接影響這一過程。Slug蛋白就是軟骨分化中的一種重要負(fù)性調(diào)節(jié)子，其降解受到鼠雙微體基因MDM2的調(diào)控。而miR221下調(diào)MDM2，抑制了Slug的降解，從而阻礙人軟骨生發(fā)層細(xì)胞的增殖[29]。

此外，有體外研究[30]證明，人MSC外泌體也可促進(jìn)人椎間盤中髓核細(xì)胞的增殖，但其具體機(jī)制仍不清楚。

2.3 細(xì)胞基質(zhì)的合成與降解 關(guān)節(jié)軟骨的形態(tài)和功能是由軟骨細(xì)胞與其間質(zhì)共同支持的。細(xì)胞外基質(zhì)主要含Ⅱ型膠原和蛋白聚糖以維持拉力強(qiáng)度和硬度。而在軟骨細(xì)胞外，還有一層狹窄的基質(zhì)條帶被特稱為“細(xì)胞周基質(zhì)”，其富含基底膜聚糖、聚糖蛋白、透明質(zhì)酸、膠原(以Ⅵ型和Ⅸ型膠原為主)、纖連蛋白。軟骨細(xì)胞胞膜上的感受器可感受生物化學(xué)和生物力學(xué)的變化且作為細(xì)胞周基質(zhì)中分子的受體，與之發(fā)生聯(lián)系，以保護(hù)軟骨細(xì)胞適應(yīng)變化。在OA過程中，軟骨細(xì)胞與細(xì)胞周基質(zhì)間正常的聯(lián)系被破壞，通過異常的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，金屬蛋白酶MMPs、聚蛋白多糖酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)被激活，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解[31]。

MSC外泌體中的miRNA可能在抑制軟骨ECM降解中發(fā)揮著重要作用。miR125b可抑制白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)誘導(dǎo)的人軟骨細(xì)胞中ADAMTS4的上調(diào)[32]。miR320則可下調(diào)IL-1β干預(yù)的人軟骨細(xì)胞中MMP13的表達(dá)，從而抑制ECM的降解[33]。

此外，體外研究[30]發(fā)現(xiàn)，人MSC來源外泌體可被退變的人髓核細(xì)胞攝取，抑制其MMP1、3的表達(dá)，并改善基質(zhì)合成情況。

2.4 免疫調(diào)節(jié) 損傷常伴隨著炎癥微環(huán)境的紊亂，IL-1β、IL-6、IL-8和MMP3等炎性細(xì)胞因子上調(diào)，加劇了隨后的軟骨基質(zhì)降解[34]。而MSC則可通過干擾素IFN-γ、TGF-β1、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)、血紅素加氧酶-1(hemeoxygenasel，HO-1)、IL-6和前列素E2(prostaglandin E2，PGE2)等物質(zhì)的協(xié)同作用發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，從而減輕炎癥造成的軟骨損傷[35]。

MSC外泌體富含超過200種具有免疫調(diào)節(jié)作用的蛋白，就使其成為了發(fā)揮這種協(xié)同作用的良好載體[36]。與此相一致的研究[37]結(jié)果表明，MSC外泌體可誘導(dǎo)IL-10和TGF-1β等抗炎因子高表達(dá)，并降低人單核巨噬細(xì)胞中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表達(dá)水平。

此外，研究[38]已證實(shí)，補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活在OA發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。而MSC外泌體所富含的CD59則可通過和組成補(bǔ)體攻擊復(fù)合物的C8、C9結(jié)合，阻止MAC介導(dǎo)的細(xì)胞溶解，從而阻止OA的發(fā)展。

除去上述4個(gè)方面，MSC外泌體還可能通過調(diào)控細(xì)胞程序性死亡而具有對(duì)OA和椎間盤退變的潛在治療應(yīng)用價(jià)值。近期研究[39]發(fā)現(xiàn)，MSC外泌體可通過攜帶的miR-21限制PTEN活性，繼而激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制髓核細(xì)胞的凋亡。

3 軟骨細(xì)胞外泌體在骨科退行性疾病中的作用

人們對(duì)軟骨來源外泌體的認(rèn)識(shí)是從關(guān)節(jié)軟骨囊泡(articular cartilage vesicle，ACV)的發(fā)現(xiàn)開始的[40]。這類最早發(fā)現(xiàn)于OA患者關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的囊泡直徑在50～250 nm，包括微囊泡和外泌體。此外，當(dāng)時(shí)的研究[41]發(fā)現(xiàn)，正常軟骨來源的ACV與OA軟骨ACV內(nèi)容物的蛋白含量、致礦化能力均有顯著差異。后續(xù)研究[42-44]證實(shí)，OA軟骨細(xì)胞ACV可形成病理性的鈣鹽結(jié)晶，且其與正常軟骨細(xì)胞ACV內(nèi)容物的蛋白質(zhì)、RNA成分均不同。OA軟骨ACV中蛋白聚糖含量下降，而玻連蛋白、發(fā)育內(nèi)皮基因1(developmental endothelial locus-1，DEL-1)、絲氨酸蛋白酶HtrA1的表達(dá)上升，與OA患者關(guān)節(jié)軟骨的變化相符。此外，通過ACV進(jìn)行的細(xì)胞物質(zhì)交流，OA軟骨細(xì)胞ACV可影響正常細(xì)胞的表型，從而加重OA。但目前對(duì)ACV中微囊泡和外泌體在上述過程中各自的作用仍未完全闡釋清楚。

同樣地，人們也在嘗試探究正常軟骨細(xì)胞來源的外泌體對(duì)軟骨再生和修復(fù)的作用。研究人員提取了成熟兔軟骨細(xì)胞來源的外泌體，并注射到預(yù)先植入軟骨祖細(xì)胞-海藻酸鈉移植物的小鼠皮下。體內(nèi)外研究[45]均證實(shí)，軟骨來源的外泌體促進(jìn)了軟骨祖細(xì)胞的穩(wěn)定異位軟骨形成。這個(gè)發(fā)現(xiàn)提供了一種合適的軟骨生成誘導(dǎo)物，以修復(fù)軟骨的缺損。

近期研究[46]還發(fā)現(xiàn)，正常人軟骨細(xì)胞與OA軟骨細(xì)胞分泌的外泌體中miRNA的表達(dá)譜有明顯差異。通過差異分析，研究者發(fā)現(xiàn)OA軟骨細(xì)胞分泌的外泌體中miR-95-5p水平顯著下調(diào)。而過表達(dá)miR-95-5p的人原代軟骨細(xì)胞外泌體則可通過抑制組蛋白去乙酰化酶(HDAC)2/8的活性，從而解除其對(duì)軟骨特異性基因Ⅱ型膠原α1(COL2A1)、蛋白聚糖aggrecan等表達(dá)的抑制，并抑制IL-1β、MMPs的表達(dá)，從而減少軟骨破壞。

有趣的是，軟骨細(xì)胞外泌體內(nèi)miRNA的表達(dá)譜與其親本細(xì)胞也有明顯差異。在該研究[47]親本細(xì)胞和其外泌體所涉及的全部372種miRNA中，有62種在親本細(xì)胞和其外泌體中表達(dá)存在差異。在軟骨細(xì)胞外泌體差異富集的前20種miRNA中，不乏已報(bào)道與OA等軟骨疾病的發(fā)生、發(fā)展及軟骨再生、修復(fù)相關(guān)者，提示軟骨細(xì)胞分泌的外泌體在軟骨分化和維持軟骨細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要作用，見表1。

表1 軟骨細(xì)胞來源外泌體中miRNA在軟骨疾病發(fā)生、修復(fù)及再生

4 其他細(xì)胞來源外泌體在骨科退行性疾病中的作用

在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)患者的關(guān)節(jié)囊滑液中，存在著高含量的細(xì)胞因子、趨化因子，而滑膜的炎癥和新生血管形成與RA和OA的發(fā)展均密不可分。在RA患者中，滑膜成纖維細(xì)胞(synovial fibroblast, SFB)可通過來自于粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等活化的免疫細(xì)胞釋放的外泌體調(diào)節(jié)其炎性物質(zhì)的釋放[52]。類似地，在OA患者中，炎癥刺激下的SFB也扮演了加重OA發(fā)展的負(fù)面角色。據(jù)報(bào)道[53]，IL-1β刺激的SFB可通過其釋放的外泌體在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)出類似OA的病理表現(xiàn)。

目前髓核細(xì)胞外泌體的作用研究甚少。但有報(bào)道[30]發(fā)現(xiàn)，正常的人髓核細(xì)胞外泌體具有促進(jìn)BMSC遷移和向髓核樣細(xì)胞分化的作用，提示利用健康髓核細(xì)胞外泌體治療椎間盤退變的潛在價(jià)值。

5 外泌體對(duì)骨科退行性疾病的應(yīng)用展望

由于應(yīng)用MSC對(duì)OA患者治療的結(jié)果基本證明了這一方式的安全性，因此推測(cè)MSC來源外泌體應(yīng)具有類似的生物安全性。但是應(yīng)用MSC來源外泌體的療效、體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和生物分布特點(diǎn)還有待大型動(dòng)物和臨床試驗(yàn)的研究。此外，應(yīng)用MSC來源外泌體促進(jìn)軟骨分化、增殖具有新生軟骨細(xì)胞肥大、血管新生等問題。與之相比，軟骨細(xì)胞來源外泌體沒有類似缺點(diǎn)，并具有同樣高效的促軟骨分化增殖特點(diǎn)[45]。但軟骨細(xì)胞外泌體與MSC來源外泌體相比，又具有親本細(xì)胞來源局限、不易大量獲得的缺點(diǎn)。這大大制約了其臨床應(yīng)用的前景。此外，對(duì)于軟骨細(xì)胞外泌體參與軟骨疾病發(fā)生、修復(fù)及再生的機(jī)制研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于MSC來源外泌體。

綜上所述，天然細(xì)胞來源外泌體內(nèi)容物在軟骨細(xì)胞再生、修復(fù)方面具有促進(jìn)和抑制的兩面性[54]。如何通過人工修飾或合成具有類似天然細(xì)胞來源外泌體結(jié)構(gòu)、功能的納米囊泡，將成為未來外泌體療法走向臨床的關(guān)鍵。