徐斐翔， 龔振宇， 薛明明

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院急診科，上海 200032

胃潰瘍是常見的消化系統(tǒng)疾病，臨床患者常表現(xiàn)為反酸、腹脹、噯氣、餐后上腹部疼痛等，其患病率高，有反復(fù)發(fā)作的傾向，嚴(yán)重者可能并發(fā)上消化道出血、穿孔、梗阻和癌變[1]。半夏瀉心湯作為《傷寒雜病論》中的傳統(tǒng)方劑，主治寒熱錯(cuò)雜之心下痞證，具有調(diào)理脾胃氣機(jī)升降的功效。大量臨床及文獻(xiàn)報(bào)道[2]證實(shí)，其針對(duì)消化性潰瘍有良好的治療效果。本研究在構(gòu)建大鼠乙酸型胃潰瘍模型的基礎(chǔ)上，探討半夏瀉心湯對(duì)大鼠乙酸型胃潰瘍模型的潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率、胃酸pH、血清一氧化氮(NO)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(i-NOS)、總一氧化氮合酶(t-NOS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)蛋白表達(dá)等指標(biāo)的影響，進(jìn)一步探索各項(xiàng)指標(biāo)間的聯(lián)系，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用SPF級(jí)Wistar健康大鼠，48只，雄性，體質(zhì)量(200±20)g。動(dòng)物由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)為SCXR(遼)2010-0001。實(shí)驗(yàn)前大鼠在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)正常飼養(yǎng)1周，溫度22～25℃，濕度40%～60%，正常飲食飲水。

1.2 試劑與儀器 半夏瀉心湯組成：制半夏、黃芩、人參、干姜、灸甘草、黃連、大棗)。奧美拉唑腸溶膠囊：常州四藥制藥有限公司，批號(hào)H10950086。大鼠血清i-NOS，t-NOS分型測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20130514；大鼠血清NO測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號(hào)20130514；大鼠胃組織VEGF抗體：武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)20130522。3-30k微量低溫高速離心機(jī)(Sigma公司，德國(guó))；PHS-3t型酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，中國(guó))；722S分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司，中國(guó))；XS125A電子天平(普利賽斯公司，瑞士)。

1.3 模型制備 采用Okabe改良法[3]。大鼠術(shù)前禁食不禁水24 h。先用乙醚吸入法麻醉大鼠，翻正反射消失，雙腿夾捏反射消失，說明大鼠已麻醉良好。將其固定于鼠板上，并于鼻旁追加麻醉，備皮，消毒，于劍突下1.5 cm處做腹正中切口2～3 cm，暴露全胃，以內(nèi)徑4 mm的玻璃管壓在胃小彎近幽門處，向管內(nèi)緩緩注入冰乙酸75 μL，30 s后用棉花吸盡冰乙酸，將胃還納回腹腔，逐層縫合，放回鼠籠，禁食不禁水1 d后正常飲食飲水飼養(yǎng)。

1.4 分組及給藥方法 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為6組：正常組，模型對(duì)照組，半夏瀉心湯低、中、高劑量組，奧美拉唑組，每組8只。半夏瀉心湯參照《傷寒論》配伍，根據(jù)人鼠用量換算公式，換算大鼠的劑量，先用水浸泡30 min，文火煎30 min，雙層紗布濾除藥渣，將藥液倒入瓶中，置冰箱備用。每天給藥2次[4]，每次給藥時(shí)，模型對(duì)照組取生理鹽水4 mL，半夏瀉心湯低劑量組取藥液1 mL/kg，半夏瀉心湯中劑量組取藥液2 mL/kg，半夏瀉心湯高劑量組取藥液4 mL/kg，用蒸餾水定容至4 mL，半夏瀉心湯組均在進(jìn)食后給藥。奧美拉唑組給予奧美拉唑腸溶膠囊0.36 g/kg，用蒸餾水定容至4 mL，1次/d，進(jìn)食前服用。連續(xù)14 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo) 給藥后14 d檢測(cè)以下各指標(biāo)。

1.5.1 胃酸pH 末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h，乙醚麻醉，開腹，暴露全胃，結(jié)扎幽門后縫合，禁食禁水，4 h后結(jié)扎賁門，剪斷賁門上端和幽門下端，分離出胃，收集胃液，1 500 r/min離心10 min，取上清，用pH計(jì)檢測(cè)pH值。

1.5.2 血清i-NOS、t-NOS、NO 采用眼球取血法，收集每只大鼠血3 mL，3 000 r/min離心15 min，取上清，按試劑盒說明書操作。

1.5.3 潰瘍指數(shù)[5]取完胃液后，將大鼠胃沿胃大彎剪開，放入生理鹽水中浸泡，清洗干凈，用濾紙吸干，置于培養(yǎng)皿上，用尺測(cè)量胃潰瘍處的最長(zhǎng)徑和最寬徑，測(cè)定潰瘍指數(shù)(UI)=最長(zhǎng)徑×最短徑×1/4×π。

1.5.4 潰瘍組織VEGF蛋白表達(dá) Western印跡檢測(cè)VEGF蛋白的表達(dá)：取制備好的蛋白樣品，10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，100 mV轉(zhuǎn)膜1 h，封閉1 h；一抗分別為抗VEGF(1∶400)、抗肌動(dòng)蛋白(抗β-actin，1∶500)，4℃過夜。洗膜后，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗IgG抗體孵育1 h，顯色液顯色，凝膠成像系統(tǒng)下拍照，計(jì)算條帶吸光度(A)值，VEGF蛋白表達(dá)水平分別以其與β-actin的A值的比值來表示。

2 結(jié) 果

2.1 對(duì)潰瘍指數(shù)的影響 結(jié)果(表1)表明：實(shí)驗(yàn)過程中，模型組死亡2只，低劑量組死亡1只，其余各組無死亡。與模型對(duì)照組相比，半夏瀉心湯低劑量組潰瘍指數(shù)減小(P<0.05)，半夏瀉心湯中、高劑量組和奧美拉唑組潰瘍指數(shù)明顯減小(P<0.01)。與奧美拉唑組相比，半夏瀉心湯高劑量組潰瘍指數(shù)減小(P<0.05)。與模型對(duì)照組相比，半夏瀉心湯低劑量組潰瘍抑制率增高(P<0.05)，半夏瀉心湯中、高劑量組和奧美拉唑組潰瘍抑制率明顯增高(P<0.01)。與奧美拉唑組相比，半夏瀉心湯高劑量組潰瘍指數(shù)增高(P<0.05)。

2.2 對(duì)胃酸pH值的影響 結(jié)果(表1)表明：與模型組相比，半夏瀉心湯低劑量組胃酸pH值無明顯變化，半夏瀉心湯中、高劑量組及奧美拉唑組胃酸pH值增高(P<0.05)。與奧美拉唑組相比，半夏瀉心湯高劑量組胃酸pH值升高(P<0.05)。

表1 半夏瀉心湯對(duì)各組大鼠胃液pH值、潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率的影響

2.3 對(duì)血清i-NOS、t-NOS、NO含量的影響 結(jié)果(表2)顯示:與模型對(duì)照組相比，半夏瀉心湯低劑量組血清i-NOS降低(P<0.05)，t-NOS升高(P<0.05)，NO升高(P<0.05)，半夏瀉心湯中、高劑量組及奧美拉唑組i-NOS顯著降低(P<0.01)，t-NOS增高(P<0.05)，NO增高(P<0.05)。與奧美拉唑組相比，半夏瀉心湯高劑量組i-NOS顯著降低(P<0.01)，t-NOS增高(P<0.05)，NO顯著增高(P<0.01)。

表2 半夏瀉心湯對(duì)各組大鼠血清NO，i-NOS，t-NOS含量的影響

2.4 對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的影響 在末次給藥后，大鼠禁食不禁水24 h后，處死大鼠，取其潰瘍?cè)钐帲琖estern blot檢測(cè)胃潰瘍組織處的VEGF蛋白的表達(dá)。結(jié)果(圖1、表3)表明：與模型對(duì)照組相比，半夏瀉心湯低、中、高劑量組和奧美拉唑組VEGF表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。與奧美拉唑組相比，半夏瀉心湯高劑量組VEGF表達(dá)增強(qiáng)(P<0.01)。

圖1 半夏瀉心湯對(duì)各組大鼠VEGF表達(dá)的影響

表3 半夏瀉心湯對(duì)各組大鼠VEGF蛋白表達(dá)的影響

*P<0.05與模型對(duì)照組相比；△△P<0.01與奧美拉唑組相比

3 討 論

消化性潰瘍作為消化系統(tǒng)的常見病，以胃和十二指腸潰瘍最為多見。有研究[6]表明，半夏瀉心湯能有效治療消化性潰瘍，其可通過提高VEGF的表達(dá)，增加再生黏膜厚度，促進(jìn)血管新生和組織修復(fù)，從而縮小潰瘍面積。也有研究[7]表明，半夏瀉心湯能改善胃黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度，并通過提高感染幽門螺旋桿菌小鼠血清中VEGF含量，增強(qiáng)機(jī)體胃黏膜保護(hù)作用。

本研究通過冰乙酸模擬人類消化性潰瘍形成。利用不同劑量半夏瀉心湯對(duì)大鼠胃潰瘍模型進(jìn)行治療，測(cè)定不同組大鼠胃酸pH、潰瘍指數(shù)、潰瘍抑制率發(fā)現(xiàn)，在潰瘍形成之后，藥物作用下潰瘍能更快愈合，且其與中藥治療存在量效關(guān)系。中等劑量與大劑量組的治療效果優(yōu)于小劑量，也優(yōu)于西藥組。結(jié)果表明，半夏瀉心湯能有效減少大鼠胃酸分泌，減少大鼠胃液量，降低大鼠胃液pH值，促進(jìn)潰瘍愈合。

NO是人體一種重要的生物介質(zhì)，由精氨酸經(jīng)NOS(一氧化氮合酶)合成，在胃潰瘍的愈合中發(fā)揮重要作用。有研究[8-9]證明，來源于i-NOS的NO對(duì)胃潰瘍有損傷作用，而來源于e-NOS的NO則對(duì)胃潰瘍有保護(hù)作用。低濃度的NO對(duì)胃潰瘍有治療作用，其機(jī)制是通過擴(kuò)張局部血管，使胃潰瘍處血流供應(yīng)增加，或作為一種信號(hào)分子，誘導(dǎo)促進(jìn)血管發(fā)生的細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)[10]，NO還可穩(wěn)定HO-1(熱休克蛋白)的mRNA[11]，而HO-1能激活血管內(nèi)皮細(xì)胞，使其合成VEGF，促進(jìn)血管發(fā)生[12]，然而高濃度的NO則可能致潰瘍。本研究中，半夏瀉心湯低、中、高組均能升高NO水平，其中高劑量組與奧美拉唑組相比，NO含量顯著增加。NOS也與胃潰瘍的發(fā)生和治療緊密聯(lián)系。乙酸型胃潰瘍中i-NOS升高，e-NOS下降。本研究證明，半夏瀉心湯能有效降低i-NOS，升高t-NOS，從而促進(jìn)潰瘍愈合，這可能與NOS的一種分型e-NOS通路有關(guān)[13]。

VEGF是一種血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)血管內(nèi)皮的增殖分化，使血管新生，從而加速潰瘍的愈合[14-15]。其發(fā)生與NO水平、vWF(von Willebrand factor Ⅷ)聚集釋放水平均有關(guān)。本研究顯示半夏瀉心湯低、中、高劑量組和奧美拉唑組均表達(dá)VEGF，其中半夏瀉心湯高劑量組和奧美拉唑組比較，半夏瀉心湯高劑量組增加局部潰瘍組織VEGF明顯高于奧美拉唑組，同時(shí)，NO水平在半夏瀉心湯低、中、高組中均高表達(dá)，尤其在高劑量組中顯著表達(dá)，提示VEGF的表達(dá)和NO水平有關(guān)。結(jié)果提示半夏瀉心湯可通過調(diào)控體內(nèi)NO、VEGF、t-NOS水平，降低i-NOS水平，擴(kuò)張局部血管供應(yīng)，促進(jìn)VEGF表達(dá)等作用與VEGF促進(jìn)血管新生協(xié)同作用，保護(hù)胃黏膜，促進(jìn)胃潰瘍快速愈合。NO及其合酶可能是半夏瀉心湯發(fā)揮作用的靶點(diǎn)之一。

綜上所述，半夏瀉心湯對(duì)胃潰瘍有良好的治療作用，促進(jìn)胃潰瘍部愈合。通過減少胃酸分泌，降低胃液pH值，提高胃黏膜保護(hù)因子NO和VEGF的表達(dá)，提高t-NOS，降低i-NOS，增加胃黏膜的防御能力。