谷思宇 楊曉梅 賀俊崎

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)系，北京 100069)

1 獲獎(jiǎng)?wù)吆?jiǎn)介

1.1 埃瑪紐埃爾·卡彭蒂耶(Emmanuelle Charpentier)

Emmanuelle Charpentier (圖1)，1968年12月11日出生于法國(guó)奧爾日河畔瑞維西。本科就讀于巴黎第六大學(xué)(UPMC)，后進(jìn)入巴斯德研究所攻讀博士學(xué)位(1986-1995)。1996-1997年，分別于巴黎巴斯德研究所和紐約洛克菲勒大學(xué)進(jìn)行博士后研究。2002年，在維也納建立自己的實(shí)驗(yàn)室。2009年6月赴瑞典于默奧微生物研究中心繼續(xù)研究，8月她的小組通過(guò)實(shí)驗(yàn)探明了CRISPR系統(tǒng)的機(jī)制。2011年之后與杜德納合作發(fā)展CRISPR技術(shù)?，F(xiàn)就職于德國(guó)柏林馬克斯·普朗克病原學(xué)研究室。

1.2 詹妮弗·杜德納(Jennifer A.Doudna)

Jennifer A.Doudna(圖2)，1964年出生于美國(guó)華盛頓特區(qū)。1895年,Doudna獲得波莫納學(xué)院學(xué)士學(xué)位，1989年，獲得哈佛大學(xué)博士學(xué)位，畢業(yè)后于麻省總醫(yī)院和哈佛醫(yī)學(xué)院進(jìn)行分子生物學(xué)博士后研究?，F(xiàn)為美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校教授，霍華德·休斯醫(yī)學(xué)研究所研究員。

圖2 Jennifer A.Doudna

2 主要科學(xué)貢獻(xiàn)：建立CRISPR/Cas9系統(tǒng)

自DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，用于制造和操縱DNA的技術(shù)已在生物學(xué)上取得了進(jìn)步。1972年，P.Berg構(gòu)建了第一個(gè)DNA重組分子，標(biāo)志著生物基因工程的核心的開(kāi)始。但在細(xì)胞和生物體的基因組中引入位點(diǎn)特異性修飾仍然難以實(shí)現(xiàn)。在CRISPR/Cas9技術(shù)用于基因組編輯之前，科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了使用DNA-蛋白質(zhì)識(shí)別原理的鋅指核酸酶(ZFNs)和TAL效應(yīng)因子核酸酶(TALENs)進(jìn)行基因編輯。然而ZFN基因編輯有很強(qiáng)的局限性，不能識(shí)別任意目標(biāo)基因序列，并且識(shí)別序列經(jīng)常受上下游序列影響。TALEN 技術(shù)利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結(jié)合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達(dá)到靶向操作內(nèi)源性基因的目的，克服了ZFN方法的不足，但在構(gòu)建過(guò)程中，TALE 分子的模塊組裝和篩選過(guò)程比較繁雜，需要大量的測(cè)序工作。對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)室的可操作性較低。因此，迫切需要一種高效、易操作的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生。

1987年，Nakata博士領(lǐng)導(dǎo)的課題組在K12大腸桿菌中研究其目的基因iap時(shí)偶然間發(fā)現(xiàn)了一段串聯(lián)間隔重復(fù)序列，且這些重復(fù)序列被含32個(gè)堿基的序列間隔開(kāi)，而當(dāng)時(shí)并不清楚這種序列的生物學(xué)意義[1]。2002年，Jansen博士領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室通過(guò)生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了一種新型的重復(fù)DNA序列家族，且該家族只存在于原核生物中，在真核生物及病毒中卻不存在，這種序列被稱(chēng)為規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)，并在含CRISPR的原核生物中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)與CRISPR相關(guān)的(cas)基因(cas1,cas2,cas3,cas4)，且cas基因始終位于CRISPR基因座附近[2]。2005年，Mojica博士等多位科學(xué)家發(fā)現(xiàn)CRISPR中的間隔序列來(lái)自于外來(lái)噬菌體或質(zhì)粒，病毒無(wú)法感染攜帶有與病毒同源間隔序列的細(xì)胞，而易侵入那些沒(méi)有間隔序列的細(xì)胞，由此他們提出CRISPR可能參與細(xì)菌的免疫功能的假說(shuō)。2007年，這一假說(shuō)被Danisco 公司的兩位科學(xué)家——Rodolphe Barrango和Philippe Horvath所證實(shí)。他們發(fā)現(xiàn)嗜熱鏈球菌中存在 CRISPR 序列，能夠幫助細(xì)菌識(shí)別、抵抗噬菌體DNA的侵入[3]。

2011年，本次諾獎(jiǎng)得主之一 的Emmanuelle Charpentier博士發(fā)現(xiàn)了CRISPR基因編輯系統(tǒng)的最后一塊拼圖-tracrRNA，由此CRISPR系統(tǒng)最終可以實(shí)現(xiàn)定向剪切目標(biāo)基因[4]。隨后Emmanuelle Charpentier博士與另一位諾獎(jiǎng)得主Jennifer A.Doudna博士合作研究CRISPR基因編輯系統(tǒng)在試管中精確切割DNA，2012年，兩人將CRISPR-Cas9的研究成果公之于眾。同時(shí)，這兩位科學(xué)家所帶領(lǐng)的研究團(tuán)隊(duì)純化出了Cas9蛋白，發(fā)現(xiàn)了Cas9 的切割作用和crRNA 的定位作用，并首次利用這個(gè)系統(tǒng)對(duì)特定DNA分子在體外進(jìn)行靶向切割化學(xué)反應(yīng)，顯示出CRISPR在活細(xì)胞中修改基因的能力。她們是最早從事把細(xì)菌天然免疫系統(tǒng)演變成CRISPR/Cas9基因編輯工具研究的科學(xué)家，她們?yōu)樵摷夹g(shù)后續(xù)的應(yīng)用勾勒出基本的框架和路線(xiàn)。

隨后，麻省理工學(xué)院的華人科學(xué)家張鋒和來(lái)自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的George Church改進(jìn)了技術(shù)，成功地將 CRISPR-Cas9系統(tǒng)運(yùn)用到真核生物(哺乳動(dòng)物)細(xì)胞中[5]，使人們開(kāi)始認(rèn)識(shí)到這一技術(shù)的變革性力量，由此極大地推動(dòng)了CRISPR/Cas9技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域內(nèi)的推廣和應(yīng)用。張鋒和他所在的Broad研究所在美國(guó)擁有CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于所有真核生物——包括植物、動(dòng)物和人類(lèi)的專(zhuān)利，這是CRISPR技術(shù)商業(yè)化最為核心的專(zhuān)利之一。

麻省理工學(xué)院教授Phillip Sharp(1993年諾獎(jiǎng)得主)曾表示：Charpentier、Church、Doudna和張鋒是建立CRISPR基因編輯技術(shù)最重要的貢獻(xiàn)者。然而基于諾獎(jiǎng)傳統(tǒng)最多頒給三人的傳統(tǒng)習(xí)俗，他們無(wú)法共享諾獎(jiǎng)。因而他認(rèn)為一個(gè)比較合理的組合是：諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給Doudna和Charpentier，以彰顯她們?cè)贑RISPR/Cas9技術(shù)建立過(guò)程中生物化學(xué)方面的研究成就；生理或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給Church和張鋒，以彰顯他們?cè)诨铙w細(xì)胞中成功建立了CRISPR/Cas9技術(shù)體系，為該技術(shù)的醫(yī)學(xué)應(yīng)用鋪平了道路。因此2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)?lì)C發(fā)給Emmanuelle Charpentier博士和Jennifer A.Doudna博士，作為該技術(shù)的初創(chuàng)者，她們獲獎(jiǎng)是實(shí)至名歸。對(duì)于此次錯(cuò)失諾貝爾獎(jiǎng)，Church博士坦然接受并認(rèn)為諾貝爾委員會(huì)做出了“一個(gè)非常明智的選擇”。他認(rèn)為他們中的任何一個(gè)人都不會(huì)因?yàn)闆](méi)有獲得諾貝爾獎(jiǎng)而受到輕視。在他看來(lái)Charpentier和Doudna做出了一項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)，這是委員會(huì)授予她們諾貝爾獎(jiǎng)的原因，而他和張鋒更像是技術(shù)發(fā)明家。他甚至還打趣說(shuō)：“如果有人想獲得如何不獲得諾貝爾獎(jiǎng)的任何技巧，那很容易?！?“通過(guò)專(zhuān)注于發(fā)明，我已經(jīng)謹(jǐn)慎地避免了所有此類(lèi)煩惱?！?他還說(shuō)，張鋒仍很年輕，“張鋒充滿(mǎn)了創(chuàng)意，我毫不懷疑他將來(lái)會(huì)獲得一兩個(gè)?！?/p>

3 CRISPR/Cas9系統(tǒng)原理

CRISPR是細(xì)菌中成簇存在的被規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，是一種古老的抵御病毒入侵的方式。在噬菌體感染細(xì)菌時(shí)，噬菌體的一段 DNA序列，會(huì)整合入細(xì)菌的CRISPR重復(fù)序列中，當(dāng)該噬菌體再次入侵時(shí)，那么這個(gè)免疫系統(tǒng)會(huì)被激活，來(lái)干擾噬菌體DNA。CRISPR 序列會(huì)轉(zhuǎn)錄出一段與先前整合的那段噬菌體DNA序列互補(bǔ)的 RNA，即 CRISPR RNA (crRNA)，然后 crRNA、Cas蛋白核酸酶組成CRISPR/Cas系統(tǒng)，特異性識(shí)別并切割噬菌體DNA[6](圖3)。

圖3 CRISPR干擾的免疫過(guò)程[6]

根據(jù)參與作用的Cas蛋白基因的序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，CRISPR-Cas系統(tǒng)可分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型三種類(lèi)型[7]，其中Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR-Cas系統(tǒng)的標(biāo)記基因分別為Cas3(屬于解旋酶家族成員) 和Cas10(具有和核酸聚合酶以及核酸環(huán)化酶同源的結(jié)構(gòu)域)，除此之外還需要多種相關(guān) Cas 蛋白，基因編輯系統(tǒng)較為復(fù)雜[8](圖4)。而Ⅱ型CRISPR-Cas是三種類(lèi)型中最簡(jiǎn)單的系統(tǒng)，僅需要一種Cas9蛋白[9]。

目前使用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)中，crRNA和tracrRNA被組合在一起改造成向?qū)NA(single-guide RNA，sgRNA)，指導(dǎo)Cas9蛋白定點(diǎn)切割DNA序列。該系統(tǒng)需要在靶標(biāo)DNA上有一段保守的前間隔區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif，PAM)作為搜索目標(biāo)。對(duì)于Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)一般為5-NGG-3′序列，一旦找到PAM，Cas9就使DNA局部解鏈，sgRNA與DNA互補(bǔ)，Cas9對(duì)靶序列進(jìn)行定點(diǎn)剪切。

4 CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用前景、挑戰(zhàn)與爭(zhēng)議

4.1 應(yīng)用前景

在過(guò)去的幾年內(nèi)，研究人員已成功地將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)應(yīng)用到多種生物中,極大地促進(jìn)了生物基因組功能的研究。

4.1.1 植物和動(dòng)物

通過(guò)基因編輯技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)植物多基因調(diào)控性狀的改良，如耐寒、抗旱和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)新品系的篩選培育。如WRINKLED(WRI)在大豆油脂合成積累中具有關(guān)鍵作用，閆麗[10]利用CRISPR/Cas9技術(shù)通過(guò)抑制轉(zhuǎn)基因受體植株中內(nèi)源基因GmWRI11a的表達(dá)，創(chuàng)制大豆GmWRI1a基因突變體，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因突變體植株中糖酵解和脂肪合成相關(guān)基因的表達(dá)量下降，解析了該基因在調(diào)控大豆種子油脂合成中的作用。在動(dòng)物研究方面，CRISPR 基因編輯技術(shù)已被成功應(yīng)用于小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)、果蠅和猴子等的基因組編輯。

4.1.2 醫(yī)學(xué)

基因編輯技術(shù)已經(jīng)用于藥物研發(fā)、疾病治療和異體器官移植等。如四川大學(xué)華西醫(yī)院胸部腫瘤科盧鈾教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了首次CRISPR-Cas9基因編輯的人體臨床試驗(yàn)，并于2016年10月進(jìn)行了首例受試者治療，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)在體外T細(xì)胞中編輯PD-1基因，經(jīng)體外T細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增，再輸回非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)受試者，首次證明了該療法在NSCLC中的安全性和可行性[11]。

4.2 挑戰(zhàn)與爭(zhēng)議

4.2.1 脫靶效應(yīng)及倫理問(wèn)題

2018年11月26日，前南方科技大學(xué)副教授賀建奎宣布一對(duì)名為露露和娜娜的基因編輯嬰兒于11月在中國(guó)健康誕生，由于這對(duì)雙胞胎的一個(gè)基因(CCR5)經(jīng)過(guò)修改，她們出生后即能天然抵抗艾滋病病毒(HIV)。這一消息瞬間震動(dòng)了世界。“基因編輯嬰兒”事件之所以引起社會(huì)強(qiáng)烈關(guān)注，一方面是因?yàn)樵摷夹g(shù)的不確定性，脫靶效應(yīng)這一有爭(zhēng)議的問(wèn)題一直影響著CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用，會(huì)給受試者和嬰兒均帶來(lái)巨大的健康隱患，另一方面則更多的是因?yàn)榇嬖趥惱韱?wèn)題，這種行為肆意踐踏基因編輯技術(shù)臨床應(yīng)用的倫理底線(xiàn)，違背有關(guān)人類(lèi)受試者試驗(yàn)研究的基本規(guī)范，編輯人類(lèi)生殖細(xì)胞基因可能會(huì)帶來(lái)無(wú)法預(yù)知的災(zāi)難性后果，出于安全風(fēng)險(xiǎn)、社會(huì)及醫(yī)學(xué)倫理等方面的考慮，基因編輯技術(shù)的應(yīng)用仍有待嚴(yán)格規(guī)范。

4.2.2 專(zhuān)利之爭(zhēng)

持續(xù)多年的CRISPR專(zhuān)利爭(zhēng)奪主要在Broad研究所的張鋒團(tuán)隊(duì)與加州大學(xué)伯克利分校的Doudna團(tuán)隊(duì)之間展開(kāi)。雖然加州大學(xué)伯克利分校率先在歐洲專(zhuān)利局提交了關(guān)于將CRISPR技術(shù)用于cell-free系統(tǒng)中專(zhuān)利的申請(qǐng)，但是張鋒和Broad研究所搶先一步在美國(guó)獲得了真核細(xì)胞CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的專(zhuān)利授權(quán)，而這正是該技術(shù)最有應(yīng)用前景的領(lǐng)域。加利福尼亞大學(xué)一方于2017年4月對(duì)這項(xiàng)裁決提起上訴，稱(chēng)他們的原始應(yīng)用覆蓋了所有細(xì)胞、植物、動(dòng)物和人類(lèi)，而不是只局限于細(xì)菌的基因編輯。2018年9月份，美國(guó)聯(lián)邦巡回上訴法院裁定，維持美國(guó)專(zhuān)利審判與上訴委員會(huì)的判決。張鋒和Broad研究所將繼續(xù)擁有在真核生物中使用CRISPR基因編輯的知識(shí)產(chǎn)權(quán)。Doudna博士雖然沒(méi)有贏得真核細(xì)胞CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的專(zhuān)利授權(quán)，但是此次榮獲諾貝爾獎(jiǎng)，也是失之東隅,收之桑榆。

5 小結(jié)

2012年，Jennifer A.Doudna和Emmanuelle Charpentier兩位教授向 《科學(xué)》投文“the Cas9 endonuclease can be programmed with guide RNA engineered as a single transcript to cleave any double-stranded DNA sequence”，僅用了20天編輯部就接受了該文。這篇文章標(biāo)志著對(duì)CRISPR/cas9系統(tǒng)的最后技術(shù)突破，為CRISPR作為基因編輯工具的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。2020年10月7日，僅8年時(shí)間，兩位教授就摘取了諾貝爾獎(jiǎng)桂冠。這主要?dú)w功于基因編輯CRISPR-Cas9技術(shù)的重要性和影響力。如今，CRISPR/Cas9技術(shù)已滲透到生命科學(xué)學(xué)科的各個(gè)領(lǐng)域。也為整個(gè)科研界一場(chǎng)深刻的革命奠定了基礎(chǔ)。