潘 誼，吳輝坤,2,3*

（1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065；2.湖北省中醫(yī)藥研究院，武漢 430074；3.湖北省中醫(yī)院，武漢 430061）

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率在全球惡性腫瘤中居第6 位，病死率居第2 位[1]。傳統(tǒng)的治療方法除手術(shù)及放、化療外，中醫(yī)中藥在肝癌的治療中也發(fā)揮了重要的作用[2]。在中醫(yī)上，無“肝癌”這一病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，將其歸為“積聚”“黃疸”“臌脹”“脅痛”等范疇，目前多稱之為“肝積”[3]。關(guān)于肝癌證候要素的理論觀點有很多，如錢英教授認(rèn)為肝郁脾腎氣血虧，痰濕疫毒為原發(fā)性肝癌的基本病因病機(jī)[4]。張建軍教授認(rèn)為正氣與陰陽平衡在肝癌的發(fā)生與發(fā)展起著重要作用[5]。魏睿等[6]提出肝癌的病機(jī)為脾胃氣虛，痰濕瘀互阻。胡文雷等[7]認(rèn)為本病外因是由感受邪毒、肝郁氣滯等引起，而正氣虧虛、臟腑功能失調(diào)是導(dǎo)致發(fā)病的根本所在，正虛以肝、脾、腎三臟虛為主，邪實以瘀血、濕熱毒邪為主。湖北省中醫(yī)院肝病研究所在長期的臨床實踐和科學(xué)研究中，提出了“毒痰瘀虛”為原發(fā)性肝癌的證素特點[8]。本研究是基于前期采用HepG2 肝癌荷瘤小鼠模型，針對毒、痰、瘀、虛各證候要素的中藥進(jìn)行篩選和優(yōu)化，形成中藥復(fù)方，將中藥復(fù)方按照證候要素“毒痰瘀虛”的組方特點進(jìn)行拆方，組方，形成針對毒痰瘀虛不同方面的中藥復(fù)方，毒痰瘀脾虛方是在證候要素毒痰瘀的基礎(chǔ)上，兼顧證候要素脾虛，進(jìn)行組方而形成的。本研究從細(xì)胞實驗方面著手，通過CCK8 法觀察毒痰瘀脾虛方對HepG2 細(xì)胞增殖的影響，ELISA 法觀察毒痰瘀脾虛方對HepG2 細(xì)胞內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。

1 實驗材料

人肝癌HepG2 細(xì)胞，武漢巴菲爾生物技術(shù)服務(wù)公司提供。SPF 級雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量180～220 g 購置武漢大學(xué)實驗動物飼養(yǎng)中心，許可證號：SYXK（鄂）2017-0095。微型高速離心機(jī)（美國Labnet，型號：C2500-R-230V）；倒置顯微鏡（NIKON，型號：Ts2型）；ICV-450 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（日本ASONE，型號：ICV-450）；全自動酶標(biāo)儀（Thermoscientific，型號：MultiskanMK3）；超凈工作臺（蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司，型號：SW-CJ-2FD）等。RPMI-1640 培養(yǎng)基（Gibco，貨號：C11875500BT）；胎牛血清（GIBCO，貨號：10099-141）；人VEGF 酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（欣博盛，貨號：EHC108）；CCK-8 試劑盒（Beyotime，貨號：E1CK-000208）；青霉素-鏈霉素溶液（雙抗，100×）（Procell，貨號：PB180120）；PBS（Procell，貨號：PB180327）；二甲基亞砜(細(xì)胞級)（Sigma-D4540，貨號：67-68-5）。毒痰瘀脾虛方由中藥葉下珠10 g，半枝蓮15 g，白花蛇舌草15 g，天葵子20 g，旋覆花10 g，皂角刺10 g，丹參20 g，姜黃20 g，黨參30 g，炙黃芪30 g，白術(shù)30 g 組成（劑量參考中藥大辭典），中藥購自湖北省中醫(yī)院中藥房，由湖北省中醫(yī)院制劑室加工成濃縮液含生藥2 g/mL，4 ℃保存?zhèn)溆?；索拉非尼?00 mg/粒）購自德國拜耳制藥公司，產(chǎn)品批號：BXHX072。

2 實驗方法

2.1 含藥血清制備 將Wistar 大鼠隨機(jī)分為空白對照組、索拉非尼組、毒痰瘀脾虛方組，每組大鼠各3 只。根據(jù)人和動物體表面積折算的等效劑量比率表，中藥灌胃劑量以10 mL/kg 計算，索拉非尼組以50 mg/kg 的劑量灌胃，每日2 次（每次間隔4 h），連續(xù)5 d，于末次給藥后1 h，乙醛麻醉，無菌條件下，經(jīng)腹主動脈采血，冷置1 h 后，離心（2 500 r/min，25 min），分離血清，放置56 ℃水浴中滅活30 min，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹9-10]。取血清加入RPMI-1640 培養(yǎng)液中，制成含10%含藥血清培養(yǎng)液。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2 細(xì)胞用含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液在37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞長到80%時，加入1～2 mL 胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

2.3 實驗分組 實驗分為空白對照血清組、索拉非尼含藥血清組、毒痰瘀脾虛方含藥血清組。

2.4 CCK8 法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期良好的HepG2 細(xì)胞，0.25%胰酶消化后，用RPMI-1640 培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗）調(diào)整細(xì)胞密度到5×104/mL，接入96 孔板，每組3 個復(fù)孔，每孔100 μL 細(xì)胞懸液，并設(shè)置空白孔，在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100 μL 無菌PBS，37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)過夜。細(xì)胞過夜培養(yǎng)貼壁后，吸去培養(yǎng)基，分別加入200、500、1 000 ng/mL 毒痰瘀脾虛方含藥血清培養(yǎng)基，每孔200 μL，5%CO2，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)24、48、72 h 后，棄掉上清，每孔加入20 μLCCK8，37 ℃培養(yǎng)2～4 h，于450 nm波長處，用酶標(biāo)儀測定各孔吸光值（OD值），并計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞生長抑制率（%）＝（空白對照組OD 值－實驗組OD 值）/空白對照組OD 值×100%。

2.5 ELISA 檢測各組細(xì)胞上清液中VEGF 的表達(dá) 取對數(shù)生長期良好的細(xì)胞，0.25%胰酶消化并用臺酚藍(lán)染色計數(shù)，用含15%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基（10%FBS+1%雙抗）制成5×104/mL 的細(xì)胞懸液，接種于24 孔培養(yǎng)板中，每組3 個復(fù)孔，每孔100 μL 細(xì)胞懸液。分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00 μL，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL。給酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min。棄去孔內(nèi)液體，每個孔中加入生物素化抗體工作液100 μL，酶標(biāo)板加上覆膜，37 ℃溫育1 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育30 min。棄去孔內(nèi)液體，每孔加底物溶液100 μL，酶標(biāo)板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。每孔加終止液100 μL，終止反應(yīng)，立即用酶標(biāo)儀在450 nm 波長測量各孔的光密度（OD 值），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品的相應(yīng)濃度。按照人VEGFELISA 檢測試劑盒說明進(jìn)行操作。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-wayANOVA）。

3 結(jié)果

3.1 毒痰瘀脾虛方含藥血清對細(xì)胞生長抑制的影響 CCK8 檢測結(jié)果顯示，隨著藥物濃度的升高，毒痰瘀脾虛方含藥血清對HepG2細(xì)胞的抑制作用越明顯，且具有明顯的濃度依耐性和時間依耐性，與空白對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1、表2。

表1 不同濃度含藥血清對HepG2 細(xì)胞生長抑制的影響

表2 不同作用時間對HepG2 細(xì)胞生長抑制的影響（，n =3）

表2 不同作用時間對HepG2 細(xì)胞生長抑制的影響（，n =3）

注：與空白對照組比較，# P ＜0.01

3.2 毒痰瘀脾虛方含藥血清對HepG2 細(xì)胞VEGF 表達(dá)的影響 見表3。

表3 各組培養(yǎng)液中VEGF 的蛋白濃度（，n =3）ng/mL

表3 各組培養(yǎng)液中VEGF 的蛋白濃度（，n =3）ng/mL

注：與空白對照組比較，## P ＜0.01；與索拉非尼組比較，△△P ＜0.01

4 討論

原發(fā)性肝癌惡性程度高，預(yù)后差[11-12]，典型特征就是大量新生血管的形成,并受多種細(xì)胞因子的調(diào)控，VEGF 是血管形成的重要調(diào)節(jié)因子，參與腫瘤的形成及發(fā)展的多個過程，具有促進(jìn)新生血管形成，增加血管通透性、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡的生物學(xué)功能[13]。腫瘤快速生長的過程中，需要血液供應(yīng)的支持，VEGF 是促進(jìn)腫瘤血管生成的核心細(xì)胞因子，VEGF 水平的上升或下降標(biāo)志著腫瘤的形成或減退[14]。肝癌細(xì)胞的無限增殖是肝癌難控制的主要原因之一[15]，抑制肝癌細(xì)胞的增殖是抑制肝癌發(fā)生發(fā)展的主要途徑之一，許多中藥可抑制肝癌細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用[16-18]。因此，發(fā)現(xiàn)具有抑制肝癌細(xì)胞增殖和血管生成的中藥復(fù)方，在中醫(yī)治療肝癌方面具有重要意義[19-20]。

肝癌的證候要素是毒痰瘀虛，肝癌的發(fā)生發(fā)展多由于正氣內(nèi)虛、陰陽失調(diào)，復(fù)因感受邪毒、情志郁結(jié)、飲食不節(jié)、宿有舊疾等因素?fù)p傷人體正氣，臟腑功能失調(diào)，氣血津液運行失常，產(chǎn)生氣滯、血瘀、痰濁、熱毒等病理變化，蘊(yùn)結(jié)于肝臟，相互搏結(jié)，日久形成肝癌。在肝癌發(fā)生發(fā)展的不同時期，毒痰瘀虛四大證候要素的表現(xiàn)輕重不一[16]。周仲瑛教授認(rèn)為肝癌的病因與癌毒、飲食、情志、外邪、肝病久延、素體稟賦有關(guān)，其中癌毒是最根本的原因[21]。張婷等[22]重視脾在肝癌發(fā)生中起的重要作用，認(rèn)為脾虛是根本。劉嘉輝等[23]提出肝癌的病機(jī)本質(zhì)是正虛邪實：正虛以脾虛為突出，邪實以邪氣內(nèi)蘊(yùn)、熱毒血瘀等為突出。林敏等[24]認(rèn)為，正氣虛損、臟腑失調(diào)是原發(fā)性肝癌發(fā)生發(fā)展的基本前提；癌毒內(nèi)生、邪毒盤踞是其發(fā)生發(fā)展的根本原因；氣滯血瘀、絡(luò)脈痹阻是其發(fā)生發(fā)展的重要因素；濕熱痰濁、諸邪相攻是其發(fā)生發(fā)展的致病關(guān)鍵。吳云等[25]認(rèn)為，肝癌是在正氣虧虛、臟腑失和的基礎(chǔ)上，痰、濕、瘀、毒等各種病理因素相互膠著，日久積滯而發(fā)，且邪越盛而正越虛，病變錯綜復(fù)雜。以上各醫(yī)家對肝癌病因病機(jī)的認(rèn)識側(cè)重點雖有不同，但總的不離肝癌“毒痰瘀虛”的證候要素特點。

中藥復(fù)方毒痰瘀脾虛方在組方上兼顧了肝癌毒、痰、瘀、脾虛4 個證候要素，其中葉下珠、半枝蓮、白花蛇舌草、天葵子針對證候要素“毒”；旋覆花、皂角刺針對證候要素“痰”；丹參、姜黃針對證候要素“瘀”；黨參、黃芪針對證候要素脾氣虛；全方共奏解毒、化痰、祛瘀、補(bǔ)益脾氣之效。

本研究運用血清藥理學(xué)方法[26]在大鼠中獲得毒痰瘀脾虛方含藥血清，通過CCK8 法和ELISA 法證實了毒痰瘀脾虛方具有抑制細(xì)胞增殖活性和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，抑制血管生成的作用（P＜0.01）。