彭亞婷，莫燕麗，陳書俞，王 凡，劉建浩

（1.廣州中醫(yī)藥大學，廣州 510000；2.上海中醫(yī)藥大學，上海 200000；3.三亞市中醫(yī)院，海南 三亞 572000）

腦梗死作為一種腦組織局灶性病變，臨床診治過程中通常可以通過臨床的體格檢查及影像學檢查做出明確的定位診斷。而早在1870 年Brown-Sequard 就發(fā)現腦局灶性損害時在遠離病灶區(qū)域往往呈現腦功能紊亂的現象[1-2]。本研究將觀察針刺水溝穴對急性腦梗死大鼠海馬組織星形膠質細胞GFAP（glial fibrillary acidic protein，膠質纖維酸性蛋白）、EAAT2（GLT，glial glutamate transporter，谷氨酸轉運蛋白2）表達的影響，基于星形膠質細胞探討針刺水溝穴治療急性腦梗死的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 SPF 級健康成年雄性Sprague Dawley（SD）大鼠45 只，體質量220～280 g，上海中醫(yī)藥大學動物中心提供（序號：0009740，許可證號碼：SCXK（滬）2018-0004）。隨機將大鼠分為假手術組、模型組及水溝穴組，每組于造模成功后按第6、24、72 h 再分3 個亞組，每亞組5 只。實驗過程中對動物的各項處理均符合我國科技部頒發(fā)的關于實驗動物的倫理學規(guī)定。

1.2 主要儀器與試劑 一次性無菌針灸針（華佗牌一次性針灸針，0.25 mm×13 mm，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），HANS-200E 韓氏穴位神經刺激儀（南京濟生醫(yī)療科技有限公司），實時定量熒光PCR 儀（美國ABI 公司），微型高速離心機（Mini-14k 常州邁科諾儀器有限公司），石蠟脫水機、包埋機、攤片機（常州市雅博電子設備有限公司），倒置熒光顯微鏡、成像系統(tǒng)（日本尼康）。TRIzol Reagent（Invitrogen 155596-026），氯仿、異丙醇（國藥集團化學試劑有限公司），PH 值9.0 抗原修復液、PH 值8.0 抗原修復液、PH 值6.0 檸檬酸抗原修復液、PBS 緩沖液（上海代軒生物科技有限公司）免疫組化試劑盒、DAB 顯色劑（VECTOR SK-4105）。

1.3 造模方法 模型組與水溝穴組采取改良Zea-Longa線栓法[3]制備大鼠右側大腦中動脈栓塞模型（MCAO）。參考Longa的5分制法在大鼠麻醉清醒后24 h進行評分。

1.4 針刺方法 針刺治療于造模成功后開始實施。操作者用0.5 寸針于水溝穴處進針，即在人中溝中央的上1/3 與下2/3 交界處向上斜刺2 mm，并在該部位下約2 mm 處刺入一針作為參考電極。針灸針連接韓氏穴位神經刺激儀進行針刺治療：選擇電針模式，水溝穴接電針儀負極，參考電極接正極，用5 HZ、2 mA、連續(xù)波電刺激持續(xù)30 min。每天治療1 次，分別治療各亞組相應天數。

1.5 觀察指標及檢測方法 大鼠處死后取出海馬組織。熒光定量PCR 技術檢測GFAP、EAAT2 基因mRNA 表達：用trizol 進行mRNA 的提取，提取出的mRNA進行逆轉錄，成為cDNA模板。以cDNA為模板，進行real time PCR 實驗。免疫組織化學法觀察GFAP、EAAT2 蛋白表達：石蠟切片脫蠟至水。阻斷內源性過氧化物酶，抗原修復，血清封閉，加一抗、二抗。DAB 顯色，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，蒸餾水沖洗切片終止顯色。復染細胞核，脫水封片。最后記錄染色強度和陽性細胞數。

1.6 免疫組化評分標準 染色強度評分標準：無染色（0 分），淺黃色（1 分），淺棕色（2 分），棕黃色（3 分）；陽性細胞數評分標準：細胞染色強度≤5%（0 分），≤25%（1 分），≤50%（2 分），≤75%（3分），≤100%（4 分）。免疫組化總評分=染色強度評分+陽性細胞數評分。

2 結果

2.1 各組大鼠神經行為學Longa 評分 見表1。

表1 各組大鼠神經行為學Longa 評分比較（，n =5）

表1 各組大鼠神經行為學Longa 評分比較（，n =5）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 熒光定量PCR 分析結果

2.2.1 各組大鼠海馬組織中GFAP mRNA 表達 見表2。

表2 海馬組織中GFAP mRNA 表達（，n =5）

表2 海馬組織中GFAP mRNA 表達（，n =5）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2.2 各組大鼠海馬組織中EAAT2 mRNA 表達 見表3。

表3 海馬組織中EAAT2 mRNA 表達（，n =5）

表3 海馬組織中EAAT2 mRNA 表達（，n =5）

注：與假手術組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.3 免疫組化分析結果

2.3.1 各組大鼠海馬組織中GFAP 免疫組化標記結果方差分析結果顯示（圖1），6、24、72 h 3 個時間點，與模型組比較，水溝穴組GFAP蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），與假手術組比較，6、72 h 模型組GFAP 蛋白表達量均顯著增加（P＜0.05），6、24、72 h 3 個時間點，水溝穴組GFAP 蛋白表達量與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 GFAP 蛋白表達

2.3.2 各組大鼠海馬組織中EAAT2 免疫組化標記結果 方差分析結果顯示（圖4），6、24、72 h 3個時間點，與模型組比較，水溝穴組EAAT2 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），與假手術組比較，6 h 模型組EAAT2 蛋白表達量均顯著增加（P＜0.05），與假手術組比較，72 h 水溝穴組EAAT2 含量顯著降低（P＜0.05），6、24 h 水溝穴組EAAT2 蛋白表達量與假手術組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖2 EAAT2 蛋白表達

3 討論

星形膠質細胞是腦和脊髓中特有的膠質細胞。星形膠質細胞的功能包括：對形成血腦屏障的內皮細胞的生物支持，向神經組織提供營養(yǎng)，在鈣離子介導下將線粒體釋放至細胞外以提高鄰近神經元存活率[4]，以及對腦損傷后腦和脊髓的修復和瘢痕形成的作用[5]等。當急性腦梗死發(fā)生后，星形膠質細胞可以通過代謝支持、抗氧化以及分泌神經保護物質發(fā)揮神經保護作用[6]，如星形膠質細胞可以通過谷氨酸轉運體攝取突觸間隙中過量的谷氨酸，發(fā)揮神經保護作用[7]，同時ATP 受體（P2 受體）在星形膠質細胞中高度表達，在缺血、缺氧條件下，星形膠質細胞外ATP 濃度升高，ATP 通過激活ATP 受體，釋放谷氨酸，參與興奮毒性，此時較低濃度P2 受體拮抗劑就可以有效阻止神經元損傷[8]。當發(fā)生急性腦梗死時，海馬CA1 區(qū)椎體神經元對缺血缺氧傷害極為敏感，是腦神經損傷最常受累部位[9]。杜一星等[10]研究發(fā)現，在MCAO 大鼠模型造模后4 h 缺血側SD 波由梗死區(qū)向遠隔區(qū)域海馬結構擴散，利用CSD 阻滯劑MK-801 后海馬神經元損傷顯著減輕。GFAP 是公認的星形膠質細胞特異性標志物，在腦缺血損傷過程中，高表達GFAP 蛋白可吞噬細胞外的有害的神經介質，保持內部環(huán)境穩(wěn)定[12]。腦梗死急性期半暗帶區(qū)GFAP 表達明顯增加可改善腦缺血時局部腦血流，促進星形膠質細胞增值[13]。EAAT1 和EAAT2 是哺乳動物中樞神經系統(tǒng)谷氨酸轉運蛋白的主要形式，EAAT2 在海馬和大腦皮層含量最豐富。

水溝穴是“醒腦開竅”針法的主穴之一[14]，腦梗死急性期針刺水溝穴可醒腦神、開清竅[11，15]。其作用機制為通過針刺水溝穴激活三叉神經—腦血管系統(tǒng)，興奮腦神經元，改善腦血流[16-17]。有研究證實針刺水溝穴對PKC 蛋白水平和活性進行調節(jié)[18]。此外，電針水溝穴可改善腦缺血再灌注大鼠的神經功能[19]?？赡芡ㄟ^降低腦缺血再灌注大鼠海馬CA1 區(qū)L-Ca2+通道的電流幅度，減少L-Ca2+通道開放時間，抑制神經細胞內鈣超載的作用，促進腦缺血再灌注大鼠神經功能的恢復[20]。從實驗結果可以初步推斷，針刺水溝穴可以減少有害神經介質以保護腦神經進一步受損，適時調控GFAP、EAAT2 的分泌量，通過針刺干預使星形膠質細胞中GFAP、EAAT2 在不同病程階段表現出不同程度的蛋白表達。