曹 路 ，魏 巖，尤 文，柴晶美，段繼昌，丁艷霞，周麗雅*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117；2.吉林省藥品檢驗(yàn)所，長(zhǎng)春 130033）

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)提供的癌癥現(xiàn)狀數(shù)據(jù)[1]顯示，2018 年癌癥死亡人數(shù)為960 萬(wàn)，且一半以上的死亡病例發(fā)生在亞洲，消化道癌占男性全部癌癥的50%[2]。目前關(guān)于胃癌的研究[3]表明，胃癌的產(chǎn)生是源于胃黏膜炎癥的日久不愈，逐漸演變成胃癌。從炎癥[4]病變到癌癥病變，促炎因子發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在炎癥致癌的過(guò)程中，炎癥因子主要是通過(guò)改變體內(nèi)的環(huán)境，進(jìn)而影響原癌基因和抑癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞朝著癌變方向轉(zhuǎn)化。脾胃濕熱證病勢(shì)纏綿、病程較長(zhǎng)，主要表現(xiàn)為炎性病變。本實(shí)驗(yàn)將從血清Th1/Th2（促炎/抗炎）細(xì)胞因子IFN-γ/IL-4 的水平、胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2 和抑癌基因p53 蛋白表達(dá)方面研究辛開(kāi)苦降法對(duì)脾胃濕熱證小鼠的作用機(jī)制。

醫(yī)院節(jié)能項(xiàng)目制定的原則為：在安全的前提下，保障服務(wù)的品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)高效運(yùn)行。醫(yī)院結(jié)合各用能系統(tǒng)的特點(diǎn)，以科室為單位，提出節(jié)能方案。在能源管理平臺(tái)的協(xié)助下，總務(wù)處各科室對(duì)提出的節(jié)能方案開(kāi)展調(diào)研，分析可行性，上報(bào)獲批后，確定節(jié)能方案。

但是從讀者利用圖書(shū)館的信息行為來(lái)看，出現(xiàn)了借書(shū)量逐年下降、查找資料首選不一定是圖書(shū)館、入館人次減少、對(duì)圖書(shū)館的利用以自習(xí)為主、傳統(tǒng)咨詢量減少、數(shù)字資源利用率在提高等變化。以陜西省7所211大學(xué)圖書(shū)館為例，從2011年到2016年，圖書(shū)外借量均出現(xiàn)1萬(wàn)-32萬(wàn)不等的數(shù)量減少。

1 實(shí)驗(yàn)材料

2 月齡健康昆明小鼠（SPF 級(jí)）60 只，體質(zhì)量20～30 g [遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（遼）2019-005]。連樸飲藥物組成：姜厚樸15 g，黃連10 g，制半夏10 g，石菖蒲15 g，焦梔子15 g，淡豆豉10 g，蘆根30 g。將中藥復(fù)方按照《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[5]的煎煮方法，得到藥液后低溫濃縮至每1 mL 藥液中含生藥量1.2 g（根據(jù)《中藥藥理學(xué)》人鼠等效劑量換算），4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。南京建成公司提供的小鼠IFN-γ、IL-4 的ELISA 試劑盒和DAB 顯色試劑盒；賽維爾生物科技有限公司提供即用型p53 一抗、Bcl-2 一抗、PBS 緩沖液。

思路剖析 由三角形的中位線和平行四邊形的性質(zhì)可知，BC∥EF且BC=2EF，所以求BC的長(zhǎng)就轉(zhuǎn)化為求EF的長(zhǎng)．而在直角三角形EFN中，只知所以需求其銳角的某個(gè)三角函數(shù)值或找出三邊之間的數(shù)量關(guān)系．由AB=OB和E為OA的中點(diǎn)想到連接BE，則BE⊥AC．又∠BCE=∠CEF=45°，所以△EBC為等腰直角三角形，得BM=EM=EF，則四邊形EFMB為平行四邊形，得運(yùn)用勾股定理可得故

2 實(shí)驗(yàn)方法

3.2 小鼠胃腸組織形態(tài)學(xué)變化 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常組小鼠胃黏膜層胃上皮結(jié)構(gòu)完整，胃小凹結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞排列緊密，固有層胃腺豐富，主細(xì)胞、壁細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯炎癥（圖1-A）。與正常組比較，模型組黏膜層少見(jiàn)上皮細(xì)胞脫落；固有層局部可見(jiàn)胃腺減少，結(jié)締組織增生（黃色箭頭）；黏膜下層可見(jiàn)水腫，結(jié)締組織排列疏松（紅色箭頭）；固有層與黏膜下層可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)（藍(lán)色箭頭）（圖1-B）；與模型組比較，連樸飲低、中、高劑量組隨藥物濃度增加，黏膜層上皮細(xì)胞脫落明顯減少，固有層與黏膜下層淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。連樸飲高劑量組除黏膜層局部可見(jiàn)少量上皮細(xì)胞脫落外，固有層胃腺豐富，主細(xì)胞、壁細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯炎癥（圖1-CDE）。陽(yáng)性藥組固有層胃腺豐富，主細(xì)胞、壁細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，黏膜下層可見(jiàn)水腫，結(jié)締組織排列疏松，并伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1-F）。

2.2 動(dòng)物給藥 正常組：常規(guī)飼養(yǎng)，每日10:00 定時(shí)投放食物和水，溫度25～28 ℃、濕度70%～80%。濕熱模型組：采用內(nèi)因濕熱法造模[6]，在造模之前12 h開(kāi)始禁食但不禁水。用高脂高糖飼料和蜂蜜水喂食。造模成功后，生理鹽水灌胃，每日1 次。連樸飲低、中、高劑量組：造模成功后，連樸飲給予小鼠灌胃，每日1次。陽(yáng)性藥組：造模成功后，黃芩滑石湯灌胃，每日1次。共治療7 d。給藥期間自由進(jìn)食、飲水。每天觀察其一般情況，記錄精神狀態(tài)、進(jìn)食、活動(dòng)和大便情況。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）的形式進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)描述。組間比較采用方差分析。

3.1 小鼠血清中IFN-γ、IL-4 以及IFN-γ/IL-4 的表達(dá)水平 見(jiàn)表1。

3.3 小鼠胃腸組織Bcl-2 和p53 蛋白表達(dá)水平 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠胃腸組織Bcl-2 和p53 蛋白表達(dá)水平明顯升高；與模型組比較，連樸飲低、中、高劑量組Bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），可抑制Bcl-2 蛋白表達(dá)；連樸飲低、中、高劑量組均可明顯抑制p53 蛋白的表達(dá)（P＜0.01 或P＜0.05）（見(jiàn)圖2）。

2.3 標(biāo)本采集 在取材的前一天開(kāi)始禁食不禁水，取材前共禁食24 h。眼球取血1 mL，靜置1 h 后以3 000 r/min 離心10 min，取上層血清置于EP 管中，于-20 ℃冰箱中保存待測(cè)。小鼠眼球取血后，脫頸處死，剪取胃竇、十二指腸、大腸、回腸、盲腸，上述組織各取一半置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上，脫水，浸蠟，包埋，3 μm 切片，HE 染色。另一半置于液氮中冷凍保存，做WB 實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果

在當(dāng)前對(duì)蛋雞養(yǎng)殖影響最大的應(yīng)該莫過(guò)于雞蛋的藥物殘留超標(biāo)問(wèn)題，隨著國(guó)家食品安全監(jiān)管的不斷加強(qiáng)，加上農(nóng)業(yè)部推行的“動(dòng)物用抗菌素減量化使用”行動(dòng)，抗生素的使用趨于規(guī)范化，藥物飼料添加劑也逐漸地退出，以往的蛋雞疾病防控措施已經(jīng)不再適用，由于抗生素的不規(guī)范使用造成的雞蛋藥物殘留超標(biāo)問(wèn)題已經(jīng)成了許多蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)的噩夢(mèng)，許多養(yǎng)殖場(chǎng)因此受到了處罰，甚至還有的面臨著牢獄之災(zāi)。

表1 小鼠血清中IFN-γ/IL-4 表達(dá)水平（，n =10）

表1 小鼠血清中IFN-γ/IL-4 表達(dá)水平（，n =10）

注：與正常組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.1 分組與造模 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分成6組，分別為正常組，模型組，黃芩滑石湯組，連樸飲低、中、高劑量組，每組10 只，雌雄各半?？瞻捉M普通飼料喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)，即在普通飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上，加用200 g/L 蜂蜜水自由飲用，且隔日按小鼠體質(zhì)量灌服油脂10 g/kg，10 mL/kg 白酒（紅星二鍋頭56 度，北京紅星股份有限公司）。共30 d。

圖1 小鼠胃腸組織形態(tài)學(xué)改變（HE 染色×200）

2.4 指標(biāo)檢測(cè) HE染色法觀察胃腸組織形態(tài)學(xué)改變，檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-4 以及IFN-γ/IL-4 表達(dá)水平，WB 法檢測(cè)胃黏膜上皮細(xì)胞凋亡基因相關(guān)蛋白Bcl-2、p53 的表達(dá)。

4 討論

圖2 小鼠胃組織Bcl-2 和p53 的蛋白表達(dá)水平

脾胃濕熱證是脾濕胃熱，脾失健運(yùn)，胃失納降形成的證候。主要表現(xiàn)為：脘腹脹滿，厭食嘔逆，大便黏膩，小便色黃，頭身困重，舌苔黃膩，脈滑數(shù)或濡數(shù)。濕邪分為外來(lái)之濕和脾胃運(yùn)化失職內(nèi)生之濕2 種[7]，具有重濁、黏滯，易夾雜他邪致病的特性。濕邪不僅可以造成消化系統(tǒng)的疾病[8]，還會(huì)引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等的疾病，但以消化系統(tǒng)疾病為主。陳一斌等[9]研究表明，通過(guò)治療脾胃濕熱證的中醫(yī)療法治療慢性萎縮性胃炎治愈率高達(dá)90%。周曉華等[10]認(rèn)為脾臟是人體最大的外周免疫器官，脾胃濕熱證的患者脾的正常生理功能受到抑制，機(jī)體的免疫功能出現(xiàn)異常。中醫(yī)辛開(kāi)苦降法治療脾胃濕熱證臨床上取得良好的療效[11]，辛開(kāi)苦降法代表方劑是連樸飲，具有清熱化濕，理氣和中的功效。現(xiàn)代藥理研究[12]提示，連樸飲能降低脾胃濕熱證胃黏膜炎癥的產(chǎn)生，抑制IL-6、NF-kb的表達(dá)，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境，使胃黏膜細(xì)胞的增殖與凋亡趨于動(dòng)態(tài)平衡，阻止其向胃癌的方向轉(zhuǎn)化。錢益嘯等[13]認(rèn)為連樸飲能降低ALD、ADH 和β-EP 的表達(dá)水平，通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體的水電解質(zhì)平衡達(dá)到清熱祛濕，恢復(fù)脾胃生理功能的目的。楊春波等[14]研究表明，脾胃濕熱證導(dǎo)致人體免疫調(diào)節(jié)功能失常，容易受到病原微生物的侵襲。婁瑩瑩等[15]認(rèn)為，慢性萎縮性胃炎的治愈與Th1/Th2 的平衡有關(guān)。高慧等[16]研究表明，糜爛性胃炎的治愈可以逆轉(zhuǎn)Th1 向Th2 細(xì)胞漂移效應(yīng)，恢復(fù)Th1/Th2 的平衡。張英平等[17]認(rèn)為，Th1/Th2 失衡是引起免疫系統(tǒng)疾病的重要因素，而IFN-γ 是標(biāo)志性的Th1 型細(xì)胞因子，IL-4 可以促進(jìn)Th2 細(xì)胞增殖，Th1 和Th2 相互制約維持穩(wěn)態(tài)，當(dāng)Th1/Th2 的平衡失調(diào)時(shí)，機(jī)體的免疫功能失常，導(dǎo)致病原微生物侵襲人體，產(chǎn)生炎癥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中IFN-γ、IL-4 表達(dá)明顯升高；與模型組比較，連樸飲高劑量組小鼠血清中IFN-γ、IL-4表達(dá)明顯降低。

p53[18-19]是細(xì)胞中重要的抑癌因子，其分為野生型和突變型2 種：野生型p53 能夠抑制腫瘤的形成，促進(jìn)腫瘤惡性細(xì)胞的凋亡，維持正常細(xì)胞的生長(zhǎng)；突變型p53 出現(xiàn)在50%的癌癥中，突變型p53 失去腫瘤抑制功能，反而促進(jìn)腫瘤的形成。p53 抑制腫瘤形成的機(jī)制[20]是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或凋亡完成的。p53表達(dá)程度越高，則腫瘤預(yù)后越差[21]。研究表明[22-23]突變型p53 蛋白在腫瘤中處于高水平狀態(tài)。突變型p53所表達(dá)的蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，以便用于癌細(xì)胞檢測(cè)。本研究表明，連樸飲治療后小鼠p53 蛋白表達(dá)明顯降低。

B 淋巴細(xì)胞瘤（Bcl）-2 基因家族是細(xì)胞中重要的凋亡相關(guān)基因[24]，能夠編碼兩類蛋白：一類是抗凋亡蛋白Bcl-2，能夠抑制細(xì)胞凋亡；另一類是促凋亡蛋白Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax），能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。正常體內(nèi)抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白都會(huì)有，其表達(dá)相對(duì)量的多少能控制細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡[25]能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量維持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)衰老細(xì)胞凋亡不足時(shí)容易引發(fā)癌癥。Bcl-2 蛋白在正常細(xì)胞中表達(dá)較低[26]，在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)較高。本研究發(fā)現(xiàn)連樸飲不僅降低p53 表達(dá)，也抑制了Bcl-2 的表達(dá)。

綜上，連樸飲能夠降低炎癥因子，促進(jìn)脾胃濕熱證細(xì)胞凋亡，達(dá)到治療脾胃濕熱證的作用。