李玉榮，洪 軍,王荔楓，王梅娟

(1.全國畜牧總站,北京 100125; 2.赤峰市巴林右旗林業(yè)和草原局，內(nèi)蒙古 巴林右旗 025550)

利用基因庫保存種質(zhì)資源是植物遺傳多樣性保護(hù)的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，并被越來越多地用作瀕危植物保護(hù)的工具之一。隨著貯藏時間的延長和保存數(shù)量的增加，基因庫的管理工作面臨挑戰(zhàn)。生活力監(jiān)測是基因庫種質(zhì)資源管理工作的重要內(nèi)容，通過生活力監(jiān)測可以發(fā)現(xiàn)處于臨界值的種質(zhì)，及時進(jìn)行繁殖更新，防止種質(zhì)資源遺傳多樣性的遺失。基因庫中的材料數(shù)量繁多，如何在節(jié)省種子、節(jié)約勞動力及其他資源的情況下做到種質(zhì)資源的安全保存，是基因庫管理工作的重要課題。

目前，為了優(yōu)化生活力監(jiān)測制度和方案，分析長期貯藏后種子生活力的研究相當(dāng)匱乏[2,3]。FAO/IPGRI基因庫標(biāo)準(zhǔn)[4]推薦了生活力監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)，2013年發(fā)布了修訂版本，對種子生活力監(jiān)測做了更詳細(xì)的規(guī)定[5]。近年來，國內(nèi)外陸續(xù)出現(xiàn)了有關(guān)學(xué)者對種質(zhì)資源生活力監(jiān)測方面的研究。本文對前人的相關(guān)研究進(jìn)行了綜述，對生活力監(jiān)測間期及監(jiān)測的策略進(jìn)行了探討。

1 生活力監(jiān)測的間期

基因庫中種質(zhì)資源生活力監(jiān)測的間期取決于種子初始生活力的大小和種子壽命的長短等因素。初始生活力較低的種子貯存一定時間后，監(jiān)測結(jié)果不合格的概率較高[3]。

FAO/IPGRI基因庫標(biāo)準(zhǔn)[4]中規(guī)定，在適宜的貯藏條件下，對于初始發(fā)芽率較高的種子，一般應(yīng)在10年后進(jìn)行第1次監(jiān)測試驗，對貯藏壽命較差或初始品質(zhì)較差的種子應(yīng)在5年后進(jìn)行檢測。FAO/IPGRI修訂后的標(biāo)準(zhǔn)[5]中，生活力監(jiān)測間隔設(shè)置為預(yù)測種子生活力下降到初始生活力的85%或更低所需時間的1/3，但最長不應(yīng)超過40年。同時，在標(biāo)準(zhǔn)中技術(shù)部分要求生活力監(jiān)測間隔要根據(jù)發(fā)芽試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)整，一旦檢測到顯著下降，就應(yīng)該減小監(jiān)測間隔，“微調(diào)”預(yù)測時間。頻繁進(jìn)行發(fā)芽試驗監(jiān)測種質(zhì)材料不僅費工，而且會消耗種子資源，造成種子數(shù)量減少，需要提前進(jìn)行更新，同時，頻繁的更新又增加了選擇、遺傳漂變和遺傳完整性喪失的風(fēng)險[1]。因此，謹(jǐn)慎的管理應(yīng)該盡可能不頻繁地進(jìn)行監(jiān)測測試[6]。

預(yù)測種子的壽命是確定生活力監(jiān)測間隔的基礎(chǔ)，而不同物種之間的種子壽命存在相當(dāng)大的差異[7]。Roberts[8]根據(jù)農(nóng)作物種子在各種不同溫度和水分條件下，預(yù)測種子貯藏壽命，提出了種子生存方程，后來Ellis和Roberts[9]根據(jù)多年的研究結(jié)果，對生存方程進(jìn)行了修正，其中最重要的修正是將種子原始發(fā)芽率考慮在內(nèi)。有研究表明，利用這個指數(shù)關(guān)系對短期貯藏種子的壽命可以成功預(yù)測，但是對于長期貯藏種子壽命預(yù)測的應(yīng)用價值是有限的[6]。一方面不能長期精準(zhǔn)地保持設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的貯藏環(huán)境，比如設(shè)備或電源故障造成的停機、維修及更換，常規(guī)工作中員工的進(jìn)出等多種因素，都會引起溫度的波動變化，由于貯藏壽命與貯藏環(huán)境呈指數(shù)關(guān)系，短時間內(nèi)在較高溫或含水量高于預(yù)先設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)，都對種子實際貯藏壽命有較大影響。另一方面，種質(zhì)資源可能來自多種來源，收獲、干燥和短期貯藏的背景也不同，種子批有可能是不均勻的，很難對種子生存期進(jìn)行量化。因此，種子生存方程的預(yù)測可作為潛在種子貯藏壽命的指導(dǎo)，但不能替代長期貯藏中獲得的實際經(jīng)驗[6]。到目前為止，僅對數(shù)量有限的物種提供了生存常數(shù)的估計，對于大多數(shù)植物種來說，很少或沒有基于證據(jù)的壽命預(yù)測，因此對基因庫管理方面的建議相對有限[6]。

據(jù)估計，全球有1 750個基因庫，保存了約740萬份種質(zhì)材料[10]，這些基因庫已經(jīng)運行多年，對生活力監(jiān)測的數(shù)據(jù)分析可以作為生活力監(jiān)測間隔的參考。

我國國家作物種質(zhì)庫中23種作物1.8萬多份種子在-18 ℃下貯藏10年后，大部分種子生活力仍保持較高水平，只有95份材料出現(xiàn)了明顯的下降。其中,胡蘿卜、萵苣、棉花、胡麻、蓖麻等5種作物種子整體發(fā)芽率平均值都出現(xiàn)了顯著下降[11]。國家蔬菜資源中期庫中保存的6種蔥屬蔬菜共610 份資源經(jīng)過 21～30 年貯存后，6種蔥屬種子生活力均呈顯著下降趨勢, 建議對貯藏20 年以上的種子增加監(jiān)測頻率，將監(jiān)測間期從10年縮短至5年[12]。覃初賢等[13]在對廣西農(nóng)科院種子庫的野生稻種資源生活力監(jiān)測數(shù)據(jù)分析后,建議把不耐貯藏的作物(類型)和對生活力整體出現(xiàn)明顯下降類型的種子作為重點監(jiān)測對象，3～5 年檢測 1 次并及時進(jìn)行繁殖更新。我國國家作物種質(zhì)庫油菜種子在長期庫(-18 ℃)中保存15 年后，發(fā)芽率出現(xiàn)顯著下降，因此建議對長期庫中保存的野生近緣種或者貯藏時間在 15 年以上的油菜種子進(jìn)行密集監(jiān)測[14]。國內(nèi)的相關(guān)研究大多集中在對保存數(shù)年種子的監(jiān)測數(shù)據(jù)分析,根據(jù)生活力下降情況提出的建議，對于確定相應(yīng)物種的生活力監(jiān)測間期有借鑒參考價值，只是種類數(shù)量不多。Ellis等[6]對國際畜牧研究所中期庫(含水量5%，溫度約8 ℃) 中50個屬的豆科牧草種子貯藏30年的生活力監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，利用probit分析方法擬合各種子批的累積正態(tài)分布，與種子生存方程計算的預(yù)期壽命進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在豆科種子的50個屬的植物中，有47個屬的種子生活力達(dá)到或超過了中期種質(zhì)存貯的預(yù)期存貯期，Ellis的研究結(jié)果表明，通過種子生存方程預(yù)測種子壽命所獲得的生活力監(jiān)測間期可以在種子生活力監(jiān)測中利用。Treuren等[3]對荷蘭遺傳資源中心近4萬份種子(平均初始發(fā)芽率栽培種為92.3%，野生種為82.3%)的生活力監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，多種作物種子在-20 ℃保存時間超過25年(含水量3%～7%，近真空鋁箔袋包裝)，結(jié)果表明，更新后存貯25年，絕大多數(shù)種子活力保持良好，因此，建議長期庫種子的第1次種子生活力監(jiān)測推遲到更新后25年進(jìn)行。Ellis等[6]提出，如果有足夠的數(shù)據(jù)，建議從物種水平而不是屬的水平上進(jìn)行分析，在Treuren[3]和Ellis[6]的研究中，由于生活力顯著下降的種子數(shù)量相對較少，都沒有對單個具體物種進(jìn)行分析研究，并且在Treuren等[3]的研究中涉及作物種類也相對較少，不宜將少數(shù)物種的數(shù)據(jù)推斷到其他物種。Trapp等[2]開發(fā)了一個數(shù)據(jù)通知方法，該方法擬合了一個具有隨機種子批次特定系數(shù)的分層貝葉斯種子活力模型，對2833批次(每個批次的種子均有3～7次完整的生活力監(jiān)測數(shù)據(jù))的玉米種子制定了生活力監(jiān)測的日程表,一方面是立足在系統(tǒng)的基礎(chǔ)上建立模型，另一方面為平衡快速捕獲衰退種子的重要性和過早檢測的成本，通過對ROC曲線分析及后續(xù)測試，確定使用預(yù)測合理的分位數(shù)作為再次測定時間。

對于不能預(yù)測種子壽命的植物種子，F(xiàn)AO[5]發(fā)布的《糧食與農(nóng)業(yè)植物遺傳資源基因庫標(biāo)準(zhǔn)》推薦，如果不能估計種子的劣變期，并且材料長期保存在- 18 ℃的密閉容器中，預(yù)期壽命長的物種應(yīng)間隔10年，預(yù)期壽命短的物種應(yīng)間隔5年或更短的時間。

基因庫國際標(biāo)準(zhǔn)可以用于所有的種質(zhì)庫，在應(yīng)用時需要根據(jù)基因庫的具體情況，并與物種特有信息相結(jié)合[5]。目前，世界范圍內(nèi)運行的基因庫中，一類采用固定的間隔時間進(jìn)行監(jiān)測，另一類根據(jù)初始發(fā)芽率計算間隔時間[15]。此外，基因庫設(shè)定的監(jiān)測間隔也可以具有物種特異性，例如美國農(nóng)業(yè)部日內(nèi)瓦分部中期和長期貯藏條件相同，按照每15年對蘿卜進(jìn)行中期和長期貯藏的種質(zhì)都進(jìn)行監(jiān)測[15]。

優(yōu)化生活力監(jiān)測方案，設(shè)置合理的生活力監(jiān)測間期，過度頻繁監(jiān)測會造成大量種子和人力資源的浪費，過少則會錯過種子生活力關(guān)鍵節(jié)點，造成遺傳物質(zhì)流失的風(fēng)險，因此，生活力監(jiān)測應(yīng)在平衡種質(zhì)資源潛在流失的風(fēng)險損失與檢測成本(種子、勞動力及其他資源)的基礎(chǔ)上設(shè)置合理間隔。宋超等[16]提出，從種子入庫到種子繁殖更新這個時期即種質(zhì)安全保存期，可適當(dāng)延長初次監(jiān)測時間，在種子安全保存期的末期安排監(jiān)測或直接安排繁殖更新。種子存活曲線呈倒S形，根據(jù)種子活力喪失特性，在平臺期可適當(dāng)延長監(jiān)測周期，在臨近關(guān)鍵節(jié)點縮短監(jiān)測周期，同時根據(jù)種子老化信號研究篩選預(yù)示種子即將轉(zhuǎn)向驟降期的生物標(biāo)記作為監(jiān)測預(yù)警指標(biāo)，建立有效的監(jiān)測預(yù)警方法[17,18]。

種質(zhì)資源庫的管理系統(tǒng)，需要制定一個更復(fù)雜的監(jiān)測預(yù)警系統(tǒng),將多個種子老化信號作為生活力的生物標(biāo)記集成到一個預(yù)測工具中，從而對一個種子群體老化進(jìn)行全面的有效評估[18]，使管理者不僅僅根據(jù)最近發(fā)芽試驗結(jié)果，而且基于其在貯藏中的整體表現(xiàn)，特別是在種質(zhì)庫中預(yù)計生存能力下降將以更快的速度發(fā)生的情況，能夠及時有效地確定種子更新的需求[18,19]。

2 生活力監(jiān)測的策略

生活力監(jiān)測除了應(yīng)設(shè)置合理的監(jiān)測間期，還涉及監(jiān)測種子范圍、種子取樣、種子數(shù)量、誤差估計、發(fā)芽試驗程序、入庫及更新標(biāo)準(zhǔn)等多方面，采取策略不同，都可能會對種子生活力監(jiān)測結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。

2.1 監(jiān)測方式

管理種質(zhì)資源庫，最理想的方法是在種子入庫貯存時進(jìn)行初始試驗，預(yù)測種子何時達(dá)到存活閾值，或者按相對壽命排列種子批次，至少在處理相同種類的材料時進(jìn)行排序。通過種子最初發(fā)芽試驗確定一個種子批在貯存時生活力的準(zhǔn)確指示信息[20]。種子生活力監(jiān)測通過對相似材料(比如基于相同的作物種類和更新的年份及地點進(jìn)行分類)的代表樣品進(jìn)行抽樣，而不是對相似材料中的每一個樣品進(jìn)行檢測[3], 這樣可以在節(jié)約種子和其他資源的情況下，兼顧到每個種子批。

國內(nèi)的一些研究[11，12，21，22]大多傾向于采用逐份監(jiān)測方式。確定重點監(jiān)測對象，將不耐貯藏的作物(類型)和生活力整體出現(xiàn)明顯下降的某些繁種單位提供的種子[11，12，21]、氣候惡劣條件下生產(chǎn)的種質(zhì)批作為重點監(jiān)測對象[23]，對于貯藏能力強的種質(zhì)可適當(dāng)采用抽樣監(jiān)測[24]。

在長期庫和中期庫持有同一原始種子樣品的情況下，只有在中期庫種子耗盡或監(jiān)測結(jié)果表明有必要對長期庫種子進(jìn)行活力測試時，才能對長期庫的種質(zhì)進(jìn)行監(jiān)測[25]。中期庫種子屬的壽命的排序可應(yīng)用于監(jiān)測長期庫中種子生活力屬的優(yōu)先級排序[6]。此外，可以利用種子活力方程[9]與溫度常數(shù)一般估計值(跨物種)[26]定量估計兩種不同貯藏溫度下種子貯藏壽命的可能差異。

目前，有一些基因庫定期測試所有的存儲種子樣本，有些基因庫不定期地隨機選擇種質(zhì)進(jìn)行生活力監(jiān)測[27]。我國國家農(nóng)作物種質(zhì)庫從1991年起,有目的地選擇部分作物種子進(jìn)行生活力監(jiān)測，以了解各種作物種子整體生活力變化情況[11]。

2.2 初次發(fā)芽試驗時間及接收的標(biāo)準(zhǔn)

2013年修訂后的標(biāo)準(zhǔn)[5]要求初次試驗在收到樣品后盡快測定，最遲在基因庫收到樣品后12個月完成。大多數(shù)栽培作物種子的初始萌發(fā)值應(yīng)超過85%。對于某些特殊的物種，以及通常不能達(dá)到高萌發(fā)水平的野生種和林木種子，可以接受較低的萌發(fā)百分比。在種質(zhì)庫接收的種質(zhì)是小數(shù)量種子的情況下，因這些種子是送來更新的，就沒有必要進(jìn)行種子的初始測試，但更新種子在存貯前必須進(jìn)行測試[28]。

2.3 發(fā)芽試驗樣品數(shù)量

發(fā)芽試驗結(jié)果對基因庫管理決策至關(guān)重要，因此數(shù)據(jù)應(yīng)具有足夠的可靠性，而試驗樣本量是影響可靠性的重要因素[29]。隨著試驗樣品量的增加，試驗結(jié)果的置信區(qū)間收窄，可靠性增加[20]。因此，在初始測試中，應(yīng)使用更多的種子以增加結(jié)果的可靠性，同時為更好地預(yù)測后續(xù)貯藏中種子活力損失的預(yù)期進(jìn)展提供了可能性。同時，用于發(fā)芽的種子數(shù)量取決于收集樣品數(shù)量以及補充庫存的難易程度。根據(jù)大樣本的樣品量的多少，用于生活力監(jiān)測的試驗樣品可以是25～50粒，樣品量小于500粒的材料，也可以取10粒種子作為試驗樣品，但是少于10粒種子的測試由于樣品量太小，無法進(jìn)行有意義的統(tǒng)計分析，對于難以大量收集種子的物種，樣品量小于250粒，可能完全不需要進(jìn)行生活力測試[30]。FAO[1]依據(jù)ISTA發(fā)芽測試要求，提出初始發(fā)芽測試至少應(yīng)使用200粒種子，但如果由于資源和(或)種子有限，為節(jié)省種子，建議每次監(jiān)測試驗隨機抽取50～100粒種子，對于小的種質(zhì)數(shù)量(通常是野生物種的情況)，50?；蚋俚姆N子樣本量也是可以接受的, 但是必須認(rèn)識到發(fā)芽率低于閾值的機會很高, 應(yīng)評估發(fā)生這種情況的風(fēng)險[28]。當(dāng)種子數(shù)量非常有限時，減少生活力監(jiān)測用種量顯然是特別重要的，可以使用序列測定方法。序列測試方法能節(jié)省種子，缺點是需要多次統(tǒng)計數(shù)據(jù)，相對繁瑣。

2.4 發(fā)芽試驗方法

發(fā)芽方法是關(guān)系到試驗結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素。發(fā)芽試驗應(yīng)盡量使用最佳條件和適當(dāng)?shù)拇蚱菩菝叩奶幚?，使得所有具有生活力的種子能夠發(fā)芽[28]。目前，大多數(shù)基因庫使用ISTA國際檢驗規(guī)程中的發(fā)芽方法。在ISTA國際檢驗規(guī)程中，包括重要的農(nóng)業(yè)和蔬菜種子、樹和灌木及花、草本和藥用植物種子。

基因庫中收集的很多野生植物種子，許多種類沒有標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽方法。對于沒有方法的種子需要建立種子的發(fā)芽方法。優(yōu)先使用發(fā)芽試驗方法，當(dāng)不能去除種子休眠時，可以進(jìn)行其他測試。有些種子在較寬的條件下具有較強的耐受性和萌發(fā)能力，但只有在最適條件下才能完全萌發(fā)。在最適條件下也不能萌發(fā)的種子就是種子休眠。種子休眠問題是生活力監(jiān)測中的難題，休眠的混淆效應(yīng)會干擾對生活力監(jiān)測臨界點的識別。種子休眠隨時間的推移也發(fā)生著動態(tài)變化，初始測定方法和貯藏一定時間后的監(jiān)測方法可能也會不同。在監(jiān)測中，破除種子休眠方法應(yīng)用在已解除休眠的種子上，有時候不適合或者會傷及種子。

種子的發(fā)芽方法是否合適，可以采用統(tǒng)計方法進(jìn)行評估。如果大多數(shù)或所有有生活力的種子已經(jīng)發(fā)芽，有生活力種子和萌發(fā)種子之間沒有顯著差異時，則認(rèn)為設(shè)定的發(fā)芽條件是合適的[30]。

2.5 誤 差

影響誤差大小的因素很多?；谌有Ч恼`差水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于預(yù)期[3]，因此要盡量取得種子批中有代表性的樣品，從而降低取樣誤差。

誤差的大小與種子發(fā)芽率的高低密切相關(guān)。隨著種子發(fā)芽率的降低，誤差也會增加[28]。當(dāng)發(fā)芽率為50%時，誤差最大，當(dāng)發(fā)芽率由50%降低到0或增加到100%時，誤差是逐漸降低的。

降低發(fā)芽試驗的誤差能夠明顯提高效率[3]。因此，對需更新的樣品結(jié)果有必要進(jìn)行可靠性鑒定，避免根據(jù)不可靠的發(fā)芽試驗結(jié)果進(jìn)行不必要的更新[29]。為此，對低于閾值發(fā)芽結(jié)果要進(jìn)行重新測試，以減少或避免由于誤差導(dǎo)致的不合理更新決策。

2.6 繁殖更新標(biāo)準(zhǔn)

基因庫管理的目標(biāo)是長期保持高活力的種質(zhì),為確?；驇熘斜４娣N質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量，基因庫必須進(jìn)行繁殖更新。更新繁殖，生產(chǎn)質(zhì)量和數(shù)量最佳的新種子，應(yīng)以最小的遺傳完整性損失達(dá)到最大的成本效益[31]。

在種子基因庫中，以種子方式保存了幾十年或幾百年的遺傳資源，貯藏期間或頻繁更新期間的死亡率會造成遺傳侵蝕的風(fēng)險[32]。當(dāng)生活力下降到初始生活力85%以下時，或當(dāng)剩余種子數(shù)量少于要求的種質(zhì)代表群體3次播種量時應(yīng)該進(jìn)行更新[28]。對于勻質(zhì)的樣品，貯存期間遺傳侵蝕的風(fēng)險很低，只要在更新時植物是足夠的，發(fā)芽率可以低于85%。對于不勻質(zhì)的樣品如野生種類和地方品種，必須堅守85%的標(biāo)準(zhǔn)。對一些地方種、特殊種質(zhì)、野生種和森林種，新補充種子的生活力中很少能達(dá)到85%。在這種情況下，可以選擇設(shè)定比較低的生活力標(biāo)準(zhǔn)觸發(fā)指標(biāo)值，如70%或更低[28]。

目前,國內(nèi)的基因庫尚未有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[21]，我國國家農(nóng)作物長期庫以發(fā)芽率為60%作為自花授粉作物(自交系)更新繁殖的臨時執(zhí)行指標(biāo),地方種以發(fā)芽率下降到起始發(fā)芽率的85%進(jìn)行更新繁殖[33]。

3 小 結(jié)

保護(hù)植物遺傳多樣性，依賴長期貯存種子和優(yōu)化生活力監(jiān)測和更新頻率[34]。加強主動管理，用正確的種子處理程序和策略以限制種子的消耗和遺傳流失，對植物遺傳資源的長期、經(jīng)濟(jì)和有效的保護(hù)至關(guān)重要。為確?；驇彀踩４妫贫ê侠淼谋O(jiān)測方案，優(yōu)化監(jiān)測周期和更新頻率，需要做好以下幾個方面的工作：

1) 優(yōu)化生活力監(jiān)測方案，必須建立在平衡種質(zhì)資源潛在流失的風(fēng)險損失與檢測成本(種子、勞動力及其他資源)的基礎(chǔ)上，設(shè)置合理監(jiān)測間隔。種子繁殖更新標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)以最小的遺傳完整性損失和最大的成本效益，生產(chǎn)和繁殖質(zhì)量和數(shù)量最佳的種子。

2) 研究并制定發(fā)芽試驗的輔助方法，識別種子老化信號以確定種子老化階段，及時發(fā)現(xiàn)生活力下降的臨界點或關(guān)鍵節(jié)點，逐步建立有效的監(jiān)測預(yù)警系統(tǒng)[17,18]，以便及時更新，防止遺傳基因的流失。

3) 確定監(jiān)測重點，將不耐貯藏的作物(類型)和生活力整體出現(xiàn)明顯下降的某些繁種單位提供的種子、惡劣氣候條件生產(chǎn)收獲的種子作為監(jiān)測重點進(jìn)行監(jiān)測。

4) 生活力監(jiān)測中采取適當(dāng)?shù)谋O(jiān)測策略，兼顧全面及監(jiān)測重點，采用適宜的取樣數(shù)量和發(fā)芽方法，以減少或避免因誤差引起誤判的損失。