湛潤生，王 莉，岳新麗，田宏先，王瑞霞

(1.山西大同大學生命科學學院，山西 大同 037009； 2.山西省農(nóng)業(yè)科學院高寒區(qū)作物研究所，山西 大同 037008)

長期以來，隨著人類社會的生產(chǎn)活動，土壤重金屬逐年累積。重金屬對于土壤來說是一種不可逆性的污染物，在土壤中很難被降解，并通過食物鏈傳遞，最終在人體內(nèi)累積[1]。鎘(Cd)是一種對動植物都有毒害作用的非必需重金屬元素,被鎘污染的土壤有隱蔽性、長期性和不可逆性等特點。Cd在進入植物體后，極易在體內(nèi)富集，會影響植物的各項生理指標，延緩植物生長，甚至會使植物死亡[2]。

在眾多的重金屬污染土壤修復技術(shù)中，利用超富集植物修復重金屬污染土壤，操作簡單、成本低、效果明顯，且不會引起二次污染[3]。芥菜型油菜(BrassicajunceaL.)十字花科蕓薹屬植物，一、二年生草本，高30～90 cm，種子含油量約40%，在全國各地均有種植，是國內(nèi)主要油料作物之一。芥菜型油菜與印度芥菜同屬于十字花科蕓薹屬植物，后者對特定的重金屬具有超積累作用，經(jīng)常被作為植物土壤修復引進的植物，進一步研究表明芥菜型油菜同樣具有重金屬超累積功能，可以用于土壤重金屬污染治理[4,5]。在種子植物整個生活史中，早期種子萌發(fā)和幼苗階段是其一生中最脆弱的階段，易受外界環(huán)境因素影響，死亡率較高，因此對種子萌芽和幼苗生理指標的研究具有重要意義。本試驗選用不同濃度的鎘處理油菜種子及幼苗，探討Cd2+脅迫下對油菜種子萌發(fā)、植株光合作用、膜系統(tǒng)、抗氧化酶系統(tǒng)等方面進行研究，進而討論Cd2+對植物的損傷機理，也為利用芥菜型油菜修復重金屬污染土壤的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

晉油12號由山西省農(nóng)業(yè)科學院高寒區(qū)作物研究所提供，該品種適應性強，耐旱、抗蟲害、不易倒、產(chǎn)量高、品質(zhì)好，是由9212-2(♀)和晉油6號(♂)雜交育種而成，屬于中晚熟品種，生長期95 d左右，適宜在晉北和晉西北地區(qū)種植[6]。

1.2 試驗方法

1.2.1Cd2+對種子萌發(fā)的影響

選取油菜種子若干，用沉降法選取顆粒飽滿的種子，用75%的乙醇消毒30 min，然后沖洗掉表面的殘留物，在放有濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)放15粒種子，設(shè)置5個不同濃度的Cd2+(0、5 mg·L-1、10 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1)溶液進行處理，每組設(shè)置3個重復。培養(yǎng)期間保持濾紙濕潤，每天觀察種子的發(fā)芽情況以及培養(yǎng)皿內(nèi)的水分流失情況，每12 h添加相應溶液保持培養(yǎng)皿內(nèi)水分供應充足。用陳花等[7]的方法測定發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等指標。

發(fā)芽勢(%)=(3 d內(nèi)的發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā) 芽 率(%)=(7 d內(nèi)的發(fā)芽種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑(Gt/Dt)；

活力指數(shù)=S×∑(Gt/Dt)。

其中Gt是t日內(nèi)的發(fā)芽數(shù)；Dt為發(fā)芽天數(shù)；S為胚根鮮重，以每皿胚根的總重計算。

1.2.2Cd2+對油菜幼苗生理指標的影響

將晉油12號籽粒播種在5×10的穴盤中，期間保持營養(yǎng)土濕潤。待幼苗長到3葉期，選取長勢一致的幼苗，平均分成5組，用去離子水洗凈根部。同時在試管中加入不同濃度的Cd2+培養(yǎng)液，以蒸餾水為對照，然后將油菜苗放進試管中，以露出莖上部為宜，每組設(shè)置3個重復。將試管置于光照培養(yǎng)箱中，每日光照12 h，溫度25 ℃下培養(yǎng)。同時每12 h用震蕩培養(yǎng)箱搖瓶5～10 min，保證試管內(nèi)氧氣充足。2 d后，將幼苗從試管中取出，用蒸餾水反復沖洗，將表面的鎘離子全部沖洗干凈，濾紙吸干油菜幼苗表面的水分，將其葉子剪碎用于測定以下指標。

參照李合生[8]的實驗方法，測定以下指標：分光光度計法測葉綠素含量；硫代巴比妥酸處理，紫外分光光度計測定丙二醛(MDA)含量；高錳酸鉀滴定法測定過氧化氫酶(CAT)活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd2+對油菜種子萌發(fā)的影響

從圖1可以看出，對照處理發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別為85.71%和80%，5 mg·L-1Cd2+濃度處理時，發(fā)芽勢、發(fā)芽率分別較對照增加了7.14%和6.67%。隨著處理Cd2+濃度的升高，發(fā)芽勢、發(fā)芽率逐漸降低，濃度越高下降越明顯，50 mg·L-1Cd2+濃度時，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率達到最低，僅為對照的66.67%。

圖1 Cd2+脅迫對種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響

從圖2可以看出，晉油12號的發(fā)芽指數(shù)隨Cd2+濃度增加呈先小幅度上升后逐漸下降的趨勢。經(jīng)5 mg·L-1Cd2+濃度處理，種子發(fā)芽指數(shù)(5.571)比對照增加0.428，50 mg·L-1Cd2+濃度處理發(fā)芽指數(shù)最低(3.429)。說明低濃度的Cd2+對油菜種子的萌發(fā)有促進作用，高濃度Cd2+抑制種子萌發(fā)?；盍χ笖?shù)則隨著處理Cd2+濃度的升高而逐漸下降，說明Cd2+對胚根的生長有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯。試驗中發(fā)現(xiàn)，Cd2+處理后，種子根部發(fā)生不同程度的發(fā)黃發(fā)黑現(xiàn)象，部分植物根部發(fā)黑導致植株死亡。

圖2 Cd2+脅迫對種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的影響

2.2 不同濃度的Cd2+處理對油菜幼苗生理指標的影響

2.2.1不同濃度Cd2+處理對葉綠素含量的影響

從圖3可以看出，經(jīng)Cd2+處理的油菜幼苗體內(nèi)葉綠素含量均低于對照，并且葉綠素a、葉綠素總含量和類胡蘿卜素的含量均隨著Cd2+濃度的升高而逐漸降低。試驗過程中還發(fā)現(xiàn)經(jīng)Cd2+處理的幼苗，葉片呈不同程度的發(fā)黃、卷曲，且濃度越高越嚴重；整體表現(xiàn)為植株矮小，葉片面積小。

圖3 Cd2+脅迫對油菜幼苗葉綠素含量的影響

2.2.2不同濃度Cd2+處理對MDA含量的影響

從圖4可以看出，對照組油菜幼苗單位鮮重MDA含量為11.08 μmol·g-1；5 mg·L-1Cd2+濃度處理時，MDA含量較對照降低了3.90 μmol·g-1；10 mg·L-1Cd2+濃度處理時，MDA含量較對照降低1.88 μmol·g-1；25 mg·L-1Cd2+濃度處理時，幼苗MDA含量較對照增加0.48 μmol·g-1；50 mg·L-1Cd2+濃度處理時，其含量比對照增加4.71 μmol·g-1。隨著Cd2+處理濃度的升高，油菜幼苗單位鮮重MDA含量整體呈先降低后升高的趨勢。

圖4 Cd2+脅迫對油菜幼苗MDA含量的影響

2.2.3不同濃度的Cd2+對CAT活性的影響

由圖5可見，當Cd2+濃度為5 mg·L-1、10 mg·L-1時，CAT活性分別比對照降低了3.03 mg·(g·min)-1和2.95 mg·(g·min)-1；25 mg·L-1Cd2+濃度時，CAT活性最高，為13.99 mg·(g·min)-1；50 mg·L-1Cd2+濃度時，CAT活性為10.10 mg·(g·min)-1，比25 mg·L-1Cd2+濃度時下降了3.89 mg·(g·min)-1?？傮w來看，隨著Cd2+濃度的升高，CAT活性整體呈下降-升高-下降的趨勢。

圖5 Cd2+脅迫對油菜幼苗CAT活性的影響

3 討 論

隨著Cd2+濃度的升高，除活力指數(shù)外，種子萌發(fā)各項指標均呈先小幅升高后逐漸降低的趨勢，5 mg·L-1Cd2+濃度時,種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)均達到最大值，這一結(jié)論與鄭本川等[9]的研究結(jié)果一致。大量研究表明，低濃度Cd2+脅迫對油菜種子發(fā)芽有一定的促進作用，隨著重金屬處理濃度的升高，植株中蓄積量越多，種子萌發(fā)相關(guān)的各項指標下降愈加明顯，對植物的毒害作用也越強。

葉綠素是反映植物光合作用的重要指標之一，葉綠素含量高低可以反映出植物遭受毒害的程度。Cd2+對晉油12號的光合作用影響較大，Cd2+處理濃度越高，葉綠素含量愈低，光合系統(tǒng)被破壞程度越高。在形態(tài)上表現(xiàn)為葉片褪綠、發(fā)黃、延展性變?nèi)?，葉面積變小，葉邊緣略微卷曲，而葉片發(fā)黃是植物在遭受脅迫后的普遍現(xiàn)象。葉綠素含量降低的原因多樣，可能因為Cd2+干擾有關(guān)葉綠素合成酶的活性，使葉綠素合成受阻；同時，增加了葉綠素酶的活性，使葉綠素分解，最終表現(xiàn)為凈含量減少[10]。

抗氧化防御系統(tǒng)在近年來已作為反映分子生態(tài)毒理的指標，其中氧化自由基反應和脂質(zhì)過氧化反應在生物新陳代謝中至關(guān)重要，它們維持著相對平衡。當機體損傷時，平衡遭到破壞，發(fā)生一系列連鎖反應，膜脂過氧化產(chǎn)生MDA， 因此MDA含量通常被作為判斷膜脂過氧化作用的指標[11]。在本試驗中，MDA含量隨著Cd2+濃度的升高呈先下降后上升的趨勢。具體表現(xiàn)為植物在受低濃度的Cd2+脅迫下，MDA含量較對照低，說明膜脂過氧化作用減弱，植物的新陳代謝速率減慢；當Cd2+濃度升高后，植物所受的脅迫加重，MDA含量明顯高于對照，膜脂過氧化作用增強，膜受害程度加重，給植物組織細胞帶來了極大的損傷。目前關(guān)于重金屬損害植物的機制，徐楠研究認為，當植物吸收大量重金屬離子時，會破壞其組織內(nèi)的離子平衡，使植物在吸收利用離子時造成困難，從而影響植物生長發(fā)育[12]。在低濃度重金屬離子的脅迫下，植物組織內(nèi)的保護酶活性提高，以此消除H2O2過多造成的影響，從而維護膜系統(tǒng)的平衡；而在高濃度離子的脅迫下，保護酶活性降低，細胞膜受損，產(chǎn)生了MDA等膜脂過氧化物，使細胞膜進一步受到損傷。劉春艷研究表明，重金屬可能會與膜表面的巰基結(jié)合，破壞膜的結(jié)構(gòu)，影響膜功能，使各細胞器受損，導致細胞內(nèi)液外滲[13]。在分子水平上，重金屬還會破壞DNA和RNA的結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的構(gòu)象。

過氧化氫酶(CAT)是植物內(nèi)的抗氧化物保護酶之一。CAT在植物逆境生理、生物應答等方面有著極其重要的作用，它會清除植物體產(chǎn)生的H2O2。植物在遭受到重金屬脅迫后，植物的抗氧化系統(tǒng)也會受到不同程度的損傷[14]。試驗中低濃度Cd2+處理時，CAT活性受到抑制，說明晉油12號可能對Cd2+較為敏感；而在25 mg·L-1時，CAT活性急劇升高，植物的抗氧化能力增強；在50 mg·L-1處理下，較25 mg·L-1處理酶活性水平下降，造成植物內(nèi)H2O2積累，此時Cd2+破壞了植物的保護系統(tǒng)。徐楠[12]、劉春艷等[13]認為，CAT對Cd2+較為敏感，隨著Cd2+濃度的升高，酶活力下降迅速。周希琴等[15]研究表明，重金屬Cd2+還會對植物的可溶性糖和蛋白質(zhì)含量造成不同程度的影響，關(guān)于晉油12號的表現(xiàn)有待深入研究。

4 結(jié) 論

重金屬對植物生理生化過程的損傷研究近些年有很多報道。本研究表明，鎘脅迫后晉油12號種子發(fā)芽指標、幼苗生理指標如葉綠素、MDA含量以及CAT活性都有所變化，影響到種子萌發(fā)、植株光合作用、膜系統(tǒng)、抗氧化酶系統(tǒng)等生理生化過程，但是關(guān)于鎘對其他品種油菜的影響有待進一步研究。