董 彬， 王 君， 孫 靜， 王報貴， 孫春龍， 吳 濤

(濱州學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院 山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心， 濱州 256603)

CRISPR-Cas是近年來研究發(fā)現(xiàn)在古細(xì)菌和細(xì)菌中用來抵抗外部核酸入侵的一類獲得性免疫系統(tǒng)[1-2]。外部病毒首次侵入細(xì)菌，可使其DNA整合至宿主自身的CRISPR序列中，CRISPR序列轉(zhuǎn)錄后可以生成CRISPR RNA(crRNA)，當(dāng)與crRNA配對的外部DNA片段再出現(xiàn)時，Cas核酸酶能夠切斷這些DNA，并為細(xì)菌提供免疫保護(hù)作用[3-5]。到目前為止，CRISPR系統(tǒng)可以分為3大類型[6]：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，其中Ⅰ型和Ⅲ型在進(jìn)行DNA剪切時，需要多種Cas蛋白參與，而Ⅱ型系統(tǒng)僅需一個Cas蛋白發(fā)揮作用即可。CRISPR/Cas9是第1個成功應(yīng)用在基因編輯上的Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)[7]。CRISPR/Cas9由一段帶有與目的基因序列相同的guideRNA指引Cas9蛋白到達(dá)指定位置發(fā)揮作用，導(dǎo)致DNA雙鏈破壞(Double strand break, DSB)，利用生物體本身具有的非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ)自身修復(fù)機(jī)制，在修復(fù)時引起堿基改變達(dá)到基因編輯的目的[8-9]。現(xiàn)已證實，CRISPR/Cas9可以在酵母菌、哺乳動物細(xì)胞、小鼠、果蠅、斑馬魚、擬南芥、水稻等多個物種中發(fā)揮基因編輯作用[9-17]。

CRISPR/Cpf1是2015年新發(fā)現(xiàn)的一種Ⅱ型系統(tǒng)[18]，與CRISPR/Cas9相比，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)具有許多優(yōu)點[19-20]：1)只需一個協(xié)助RNA分子，Cas9需要2個RNA分子協(xié)助；2)Cpf1蛋白分子量相比Cas9蛋白較小，易于進(jìn)入目標(biāo)宿主；3)CRISPR/Cpf1具有獨特的識別位點序列，能使脫靶率降低；4)剪切位置與Cas9不同，選擇余地更大;5)產(chǎn)生黏性末端，便于新DNA序列插入。利用 CRISPR/Cpf1 進(jìn)行操作的基本條件是：1)研究對象能高效表達(dá)Cpf1蛋白這一核酸切割“剪刀”；2)靶基因的原型間隔序列毗鄰基序 PAM(Protospacer-adjacent motif)為 NGG，只要目的基因滿足這一基本條件，就有可能利用這一系統(tǒng)對靶基因進(jìn)行定點遺傳操作。因此，制備高特異性和靈敏性的Cpf1核酸酶抗體研究其在不同生物體中的表達(dá)、分布以及定位，將會進(jìn)一步推動CRISPR/Cpf1系統(tǒng)作為基因編輯工具的發(fā)展。目前，關(guān)于Cpf1核酸酶抗體的報道并不多見。本研究選用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞，將LbCpf1核酸酶N端166個氨基酸的DNA編碼序列進(jìn)行重組表達(dá)，并利用6×His純化標(biāo)簽得到重組蛋白作為抗原進(jìn)行動物免疫，獲得抗血清，并對純化后的抗體特異性和靈敏性進(jìn)行系統(tǒng)分析。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和動物

大腸桿菌EscherichiacoliXL1-blue、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞和pET28a質(zhì)粒購自北京全式金公司。

1.1.2 主要試劑

核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、高保真DNA聚合酶和蛋白分子量Marker均購自美國Thermo Fisher公司；質(zhì)粒提取、DNA凝膠回收相關(guān)試劑盒購自北京天根生化科技有限公司； DNA Marker購自北京全式金公司；Ni SepharoseTM6 Fast Flow蛋白純化介質(zhì)和Protein A SepharoseTM購自美國GE Healthcare公司；NC膜購自美國Pall公司；His抗體購自美國Sigma-Aldrich公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體購自美國Jackson immunoresearch公司，ECL顯色試劑購自美國Millipore公司。其他常規(guī)試劑均購自北京索來寶公司。

1.1.3 實驗動物

免疫用新西蘭大白兔2只，體重1.5～2.0 kg，由濱州畜牧獸醫(yī)研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以pMAL-c2X-6His-Cpf1質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增Cpf1基因N端166個氨基酸的DNA編碼序列，通過EcoR I和XhoI進(jìn)行雙酶切并切膠回收，連接至同樣雙酶切回收后的pET28a(+)表達(dá)載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XL1-blue中，在含有卡那霉素的LB平板中過夜培養(yǎng)，從平板中挑取陽性克隆的單菌落進(jìn)行培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，然后酶切、測序驗證。

1.2.2 Cpf1(1-166)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的條件改良

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，將陽性克隆挑至LB培養(yǎng)基中過夜活化，隨后將菌液按照5%的添加比例加入新的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min的條件下培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600=0.6)，然后分成2組，1組加入不同濃度(0.05～1.20 mmol/L)的IPTG繼續(xù)培養(yǎng)12 h后收集菌體，另1組加入0.2 mmol/L的IPTG培養(yǎng)16 h，每2 h取1次樣。將收集后的菌體進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳分析，并以未誘導(dǎo)的含pET28a(+)載體的大腸桿菌BL21(DE3)作為蛋白表達(dá)的對照。

1.2.3 融合蛋白6×His-Cpf1(1-166)的純化

按照優(yōu)化后的誘導(dǎo)表達(dá)條件培養(yǎng)含pET28a-Cpf1(1-166)重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21，收集菌體后加入裂解液(50 mmol/L Hepes，0.5 mol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L PMSF，10%甘油，20 mmol/L咪唑，4 mmol/L β-巰基乙醇，1 mg/mL溶菌酶，pH 7.4)冰上放置30 min后進(jìn)行超聲波破碎，12 000 r/min離心后收集上清液。使用5倍平衡柱體積的裂解緩沖液對Ni柱平衡，隨后加入裂解后的上清液，4 ℃過夜結(jié)合，將結(jié)合后的上清液流出，使用5倍柱體積的裂解液將Ni柱漂洗3遍，最后用洗脫液(含500 mmol/L咪唑)洗脫，獲得目的蛋白，使用Brand ford法對蛋白進(jìn)行濃度分析。

1.2.4 多克隆抗體的制備

將新西蘭大白兔飼養(yǎng)至10周大時開始免疫。首次免疫前，從兔子耳部取少量血樣，作為后期實驗中的陰性對照血清。首次免疫時，將純化后的蛋白作為抗原取2 mg 與免疫用弗氏完全佐劑充分混勻，然后將動物頸背部毛發(fā)褪去，在皮下進(jìn)行多點位注射，每只動物注射1 mg抗原，2周后進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫，抗原劑量相同，但使用弗氏不完全佐劑充分混勻，共加強(qiáng)免疫4次。最后1次免疫后，取少量血樣進(jìn)行效價測定，符合要求后，從動物股動脈取血，離心后除去血漿獲得抗血清。

1.2.5 ELISA法測定效價

使用純化后的蛋白作為酶標(biāo)板的包被抗原，并用5%濃度的脫脂牛奶在37 ℃封閉1 h，用PBS溶液對抗血清進(jìn)行分級稀釋并加入酶標(biāo)板孔內(nèi)1 h，再加入稀釋比為1∶20 000的HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗孵育1 h，最后加入TMB溶液顯色，在450 nm下測定吸光值，抗血清OD450/對照血清OD450≥ 2.0則為陽性，陽性抗血清的最大稀釋倍數(shù)即為效價。

1.2.6 抗血清的純化

將獲得的抗血清與預(yù)先使用結(jié)合緩沖液(12 mmol/L Na2HPO4，8 mmol/L NaH2PO4，pH 7.0)平衡過的Protein A抗體純化柱在4 ℃結(jié)合4 h，隨后使用3倍平衡柱體積的結(jié)合液漂洗2次，最后用洗脫緩沖液(0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.7)進(jìn)行洗脫，并用1 mol/L Tris-HCl(pH 9.0)緩沖液將洗脫組分pH值調(diào)至中性并保存在-80 ℃冰箱備用。

1.2.7 SDS-PAGE和Western Blot分析

取5 μL定量分析后的樣品加入5 μL的2×蛋白上樣緩沖液，混勻后在沸水中煮5 min，然后將20 μg樣品加至15%的凝膠中，在150 V電壓條件下電泳1.5 h，隨后使用考馬斯亮藍(lán)染液直接對電泳后的凝膠進(jìn)行分析或?qū)⒛z表面蛋白在電流作用下轉(zhuǎn)移至NC膜表面進(jìn)行抗體雜交。以5%濃度的脫脂奶粉對印跡膜在室溫下封閉1 h，然后用His 抗體(1∶2 000)或純化后抗血清在室溫下孵育1 h，再用TBST漂洗3次后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗在室溫下孵育1 h并漂洗。最后用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，化學(xué)發(fā)光掃膜儀進(jìn)行拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

使用EcoR I和XhoI酶切驗證構(gòu)建后的重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Cpf1(1-166)，結(jié)果如圖1所示，獲得了498 bp的目的基因Cpf1(1-166)，且測序正確，說明表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 Cpf1(1-166)在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的條件改良

根據(jù)表達(dá)后重組蛋白條帶灰度分析，重組Cpf1(1-166)蛋白在大腸桿菌中成功表達(dá)，分子質(zhì)量為20 ku，且IPTG的濃度變化對Cpf1(1-166)蛋白的表達(dá)水平并沒有顯著影響(圖2)。以0.2 mmol/L IPTG進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)時間的優(yōu)化時，每2 h取1次樣品，設(shè)定誘導(dǎo)6 h的蛋白表達(dá)水平為100%， 8、10、12、14和16 h的重組表達(dá)量分別為251%、238%、236%、235%和233%(圖3)。因此，表達(dá)Cpf1(1-166)的最佳條件為IPTG 0.2 mmol/L，誘導(dǎo)8 h。

1: pET28a-Cpf1(1-166) 質(zhì)粒使用EcoR I和Xho I進(jìn)行雙酶切后的條帶；M: DNA Marker

M：蛋白分子量Marker；1：未加入IPTG的空載體對照組菌體；泳道2、3、4、5、6、7、8和9分別為加入0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的菌體表達(dá)蛋白

2.3 重組蛋白的純化及Western Blot分析

為了進(jìn)一步分析重組表達(dá)蛋白的溶解性并進(jìn)行純化，使用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件對重組菌進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果顯示重組Cpf1(1-166)蛋白以水溶性形式在大腸桿菌中存在[圖4(a)]，并且Western Blot分析顯示重組蛋白為特異性表達(dá)[圖4(b)]。利用Ni柱純化獲得的Cpf1(1-166)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳和Western Blot，獲得預(yù)期分子量大小的重組蛋白(圖5)。

2.4 ELISA測定抗血清效價

將最后1次免疫后獲得的動物血清樣品梯度稀釋后進(jìn)行效價測定，在450 nm下測定吸光值，抗血清OD450/對照血清OD450≥ 2.0則為陽性，陽性抗血清的最大稀釋倍數(shù)即為效價。由結(jié)果(圖6)可知，1∶128 000為抗血清的效價。

M：蛋白分子量Marker；1：空載體對照組菌體；泳道2、3、4、5、6、7、8和9分別表示誘導(dǎo)時間為2、4、6、8、10、12、14和16 h的菌體表達(dá)蛋白

M：蛋白分子量Marker；1：未加入IPTG的空載體對照組菌體；2：誘導(dǎo)表達(dá)后全細(xì)胞裂解液組分；3：誘導(dǎo)表達(dá)后上清液組分；4:誘導(dǎo)表達(dá)后沉淀組分

(a)M為蛋白分子量Marker；1為純化后的蛋白SDS-PAGE電泳分析。(b)1為純化后蛋白Western Blot分析

2.5 多克隆抗體的特異性檢測

以重組表達(dá)Cpf1(1-166)蛋白和Cpf1蛋白的大腸桿菌作為純化后抗血清特異性檢測的對象，分析其能否識別細(xì)胞中所表達(dá)的蛋白。Western Blot顯示純化后的抗血清可以識別大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的Cpf1(1-166)和Cpf1蛋白(圖7)，分子質(zhì)量符合預(yù)期大小，說明可以用于后續(xù)對Cpf1的研究。

圖6 ELISA測定抗血清效價

(a)檢測抗血清對大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)Cpf1(1-166)的特異性結(jié)合，1：使用陰性血清檢測組；1′：使用親和純化后的抗血清(1∶1 000)檢測Cpf1(1-166)蛋白。(b)檢測抗血清對大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)Cpf1的特異性結(jié)合，1：使用陰性血清檢測組；1′：使用親和純化后的抗血清(1∶1 000)檢測Cpf1蛋白

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cpf1系統(tǒng)現(xiàn)已成功應(yīng)用在多種動物、植物和微生物中進(jìn)行基因組編輯，由于其系統(tǒng)組成更簡單，編輯效率更高，脫靶率更低，因此，越來越受到研究人員的青睞。使用CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的首要條件是細(xì)胞中得含有Cpf1核酸酶這一基因剪刀，目前往往通過在生物體中進(jìn)行Cpf1的異源表達(dá)來滿足，同時指導(dǎo)RNA在生物體胞內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，指引Cpf1至特定位置來發(fā)揮基因編輯功能。所以，對于Cpf1核酸酶在生物體中的檢測就顯得至關(guān)重要，而基于抗原抗體結(jié)合的免疫分析檢測是最常用和靈敏度較高的一類方法[21-22]。因此，具有高特異性和靈敏性的Cpf1核酸酶抗體制備就顯得尤為重要。

在抗體的制備中，單克隆抗體由于特異性和靈敏度出色，受到普遍關(guān)注，但其制備成本昂貴，費時費力也是其較為突出的缺點。以新西蘭大白兔和大鼠等作為免疫動物制備多克隆抗體的方法近年來應(yīng)用較多，其具有成本低、時間短、實驗技術(shù)要求低等特點，目前已有多種抗體已經(jīng)被成功制備。大多數(shù)抗原的制備都是通過在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，采用不同標(biāo)簽進(jìn)行親和純化而獲得，包括重組木聚糖酶、綠色熒光蛋白GFP、萊茵衣藻IFT70蛋白等[23-25]。大腸桿菌是首個應(yīng)用于外源蛋白重組表達(dá)的宿主微生物，具有遺傳背景清晰、容易培養(yǎng)、成本較低、轉(zhuǎn)化效率較高等優(yōu)點，并且其表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他表達(dá)系統(tǒng)，重組表達(dá)蛋白含量甚至?xí)^總蛋白量的30%。因此，大腸桿菌是截至目前蛋白表達(dá)應(yīng)用中使用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)。將Cpf1蛋白N端166個氨基酸與6×His標(biāo)簽在大腸桿菌中進(jìn)行重組融合表達(dá)，親和純化后免疫動物獲得抗血清，Werstenn Blot證實該抗血清能識別大腸桿菌中表達(dá)的Cpf1和Cpf1(1-166)。綜上所述，本研究成功獲得了Cpf1核酸酶的兔源多克隆抗體，并通過Western Blot實驗證實其具有較好的結(jié)合特異性，這將為Cpf1在生物體中的檢測提供工具，且將為推動CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的應(yīng)用奠定良好的實驗基礎(chǔ)。