黃宗文 王 吉 馬 宏

(1.北京理工大學(xué),北京 100081)(2.中國食品藥品檢定研究院,北京 102629)

仙臺病毒(Sendai virus,SeV)在病毒分類上屬于副黏病毒科、呼吸道病毒屬病毒,病毒核酸為單股負(fù)鏈 RNA,基因組長度 15 384個核苷酸[1-2]。1953年在日本仙臺首次發(fā)現(xiàn),命名為Fushimi株[3]。仙臺病毒可引起嚙齒類動物呼吸系統(tǒng)疾病,感染仙臺病毒的動物免疫系統(tǒng)會受到影響,可能影響藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,且被仙臺病毒感染的動物群很難凈化[4-6]。

現(xiàn)行實(shí)驗(yàn)動物微生物等級國家標(biāo)準(zhǔn)對大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠清潔級及以上等級,必檢項(xiàng)目中均含有仙臺病毒[7],但ELISA存在檢測耗時較長,包被抗原較難制備,需要免疫動物制備陽性血清等問題[8]。

實(shí)時熒光定量PCR(fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)方法有靈敏度較高、直接檢測病毒核酸并可以對核酸濃度定量檢測等優(yōu)點(diǎn)[9]。本研究建立了特異的SeV實(shí)時熒光定量PCR檢測方法,能夠快捷、準(zhǔn)確地檢測樣本中仙臺病毒的核酸含量。

裸鼴鼠具有抗衰老、耐低氧、耐疼痛等方面的特性,目前廣泛用于腦神經(jīng)、抗氧化、腫瘤等方面的研究。本文應(yīng)用建立的方法對裸鼴鼠SeV進(jìn)行了攜帶情況篩查。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及樣品:仙臺病毒、小鼠肝炎病毒(MHV-V1)、呼腸孤病毒3型(Reo3)、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV),中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量檢測室保存;小鼠肺炎病毒(PVM),美國ATCC(編號:VR-25);40只SPF小鼠,國內(nèi)某單位送檢;4只屏障環(huán)境飼養(yǎng)黃鼠樣本,國內(nèi)某單位送檢;5只6周齡清潔級小鼠,國內(nèi)某單位送檢;58份裸鼴鼠樣本,中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)。

1.1.2 主要儀器與試劑:熒光定量 PCR儀(7500 fast Real-Time PCR System),ABI公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,AMV Reverse Transcriptase,購自 Promega公司;RNA提取試劑盒,購自 QIAGEN公司;SYBR?Premix Ex TaqTMGC,TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì):將不同株仙臺病毒序列進(jìn)行比對,發(fā)現(xiàn)一段保守序列,位于RNA polymerase protein基因,序列號:NC_001552.1(8 556～15 242),對此保守序列設(shè)計(jì)引物。序列見表1。

表1 引物序列Table 1 The sequences of primers

人工合成SeV基因組12 181～12 480 DNA序列,轉(zhuǎn)入pMD19-T質(zhì)粒中,作為SeV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.2 病毒 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄:對正常雞胚尿囊液、SeV 感染雞胚尿囊液、Reo3、PVM、MHV、LCMV,進(jìn)行RNA提取操作,以提取的 RNA為模板,用AMV Reverse Transcriptase試劑盒逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:用含有目的片段的質(zhì)粒pGEM-T Easy-pol作為標(biāo)準(zhǔn)品,按 109～100copies/μL梯度稀釋,作為進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)的模板,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增體系如下:Premix 10μL,引物1μL,待檢測模板1μL,RNase-free Water 8μL,體系 20μL。 擴(kuò)增條件為:每個循環(huán) 50℃2 min,95℃10 min,95℃15 s,60℃1 m in,擴(kuò)增40個循環(huán)。

1.2.4 特異性實(shí)驗(yàn):以 SeV、Reo3、PVM、MHV、LCMV及雞胚尿囊液陰性對照為擴(kuò)增模板,檢測SeV實(shí)時熒光定量PCR檢測方法的特異性。

1.2.5 最低檢出限實(shí)驗(yàn):以109～100copies/μL 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增,每個濃度標(biāo)準(zhǔn)品各做3個平行。擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)閾值(Ct)≤35,拷貝數(shù)(copies)≥10時,對應(yīng)的最低模板濃度為方法的最低檢出限。

1.2.6 重復(fù)性和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):以 107copies/μL、106copies/μL、105copies/μL 3個不同濃度陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,擴(kuò)增3次,計(jì)算批間變異系數(shù)。

1.2.7 實(shí)時熒光定量PCR方法的應(yīng)用

1.2.7.1 用建立的Q-PCR方法對40只SPF小鼠、4只黃鼠、5只清潔級小鼠、58只裸鼴鼠肺組織檢測,同時設(shè) 109～105copies/μL質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品對照。按1.2.4擴(kuò)增體系和條件擴(kuò)增。

1.2.7.2 判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定

擴(kuò)增效率Eff%在90%～110%之間,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2＞0.99,實(shí)驗(yàn)成立。

樣品同時滿足循環(huán)閾值(Ct)≤35,拷貝數(shù)(copies)≥10,判定為陽性。其余情況判定為陰性。

1.2.8 動物樣本ELISA方法檢測:以國家標(biāo)準(zhǔn)中ELISA方法對40只SPF小鼠、4只黃鼠、5只清潔級小鼠、58只裸鼴鼠血清檢測[8]。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板,進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),模板濃度為 1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103copies/μL,擴(kuò)增曲線見圖 1,擴(kuò)增效率 Eff%為99.362%,標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)相關(guān)系數(shù)R2值為0.999。

圖1 1×107～1×103copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線Fig.1 The am p lification curve of 1×107—1×103copies/μL standard

圖2 1×107～1×103copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of 1×107—1×103copies/μL standard

2.2 方法特異性驗(yàn)證

實(shí)時熒光定量PCR檢測方法特異性檢測,分別以 SeV、Reo3、PVM、MHV、LCMV、正常雞胚尿囊液的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果如圖3所示,可以看出以SeV的 cDNA為模板擴(kuò)增曲線明顯,而以Reo3、PVM、MHV、LCMV、雞胚尿囊液的 cDNA 為模板,則無擴(kuò)增。顯示該方法可對仙臺病毒特異檢測。

圖3 SeVQ-PCR特異性檢測結(jié)果注:1:SeV;2～7:Reo3、PVM、MHV、LCMV、正常雞胚尿囊液Fig.3 Specifictesting results of SeVQ-PCRNote:1:SeV;2-7:Reo3、PVM、MHV、LCMV、normal chick embryo allantoic fluid

2.3 方法穩(wěn)定性和重復(fù)性驗(yàn)證

檢測質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品 3個濃度對應(yīng)的 Ct、標(biāo)準(zhǔn)差(CtSD)及變異系數(shù)見表2。各質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度3次檢測結(jié)果Ct的變異系數(shù)＜5%,說明該方法穩(wěn)定、可重復(fù)。

表2 熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The repeatability and stability testing results of Q-PCR

2.4 最低檢測限度結(jié)果

如圖 4、圖 5所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線擴(kuò)增效率為100.644%、相關(guān)系數(shù)R2值為0.994。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品模板濃度為10 copies/μL時仍有曲線擴(kuò)增,Ct為34.031,該方法檢測結(jié)果為10.653 copies/μL,偏差較小;可認(rèn)為最低檢測限度為10 copies/μL。

圖4 1×109～1×100copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of 1×109—1×100cop ies/μL standard

圖5 1×109～1×100copies/μL標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線Fig.5 The am p lification curve of 1×109—1×100copies/μL standard

2.5 實(shí)時熒光定量PCR方法的應(yīng)用

2.5.1 SPF小鼠檢測結(jié)果:將該方法用于40只SPF小鼠的肺組織樣本的檢測,得到擴(kuò)增曲線(圖 6)。

圖6 40只SPF小鼠擴(kuò)增曲線Fig.6 The amplification curve of 40 SPF mice

經(jīng)過熒光定量PCR檢測,40只SPF小鼠肺組織樣本的循環(huán)域值(Ct＞35)和拷貝數(shù)(copies＜10)均在檢測限之外,判定上述樣本為陰性。

2.5.2 黃鼠檢測結(jié)果:將所建立的實(shí)時熒光定量PCR方法用于4份黃鼠的肺組織樣本的檢測,標(biāo)準(zhǔn)品為109～102copies/μL,得到擴(kuò)增曲線(圖7),陽性率為 100%(表 3)。

圖7 黃鼠擴(kuò)增曲線Fig.7 The amplification curve of Sperm ophilus dauricus

表3 黃鼠檢測結(jié)果Table 3 The testing resu lts of Sperm ophilus dauricus

2.5.3 清潔級小鼠檢測結(jié)果:將所建立的實(shí)時熒光定量PCR方法用于5只清潔級小鼠樣本的檢測,標(biāo)準(zhǔn)品為109～102copies/μL,得到擴(kuò)增曲線(圖 8),陽性率為100%(表4)。

圖8 清潔級小鼠擴(kuò)增曲線Fig.8 The amplification curve of clean mice

2.5.4 裸鼴鼠檢測結(jié)果:將所建立的實(shí)時熒光定量PCR方法用于58只裸鼴鼠的肺組織樣本的檢測,得到擴(kuò)增曲線(圖9)。

表4 清潔級小鼠檢測結(jié)果Table 4 The testing results of clean mice

圖9 裸鼴鼠擴(kuò)增曲線Fig.9 The amplification curve of naked molerats

經(jīng)過熒光定量PCR檢測,58份裸鼴鼠肺組織樣本的循環(huán)域值(Ct＞35)和拷貝數(shù)(copies＜10)均在檢測限之外,判定上述樣本為陰性。

2.6 ELISA方法檢測結(jié)果

檢測樣本信息及結(jié)果見表5。

表5 ELISA方法檢測結(jié)果Table 5 The testing results of ELISA method

3 討論

仙臺病毒在嚙齒類動物中廣泛傳播,并引起動物支氣管肺炎。在小鼠中有些情況引起臨床反應(yīng),有的為隱形感染,這和宿主有關(guān),比如小鼠暴露的年齡或小鼠品系對仙臺病毒感染的敏感性[10-11]。另外,仙臺病毒的不同毒株對小鼠致病性也不同。同時仙臺病毒還是人獸共患病原,對人具有感染性,引起人的肺炎等呼吸道疾病[5]。因此,仙臺病毒是鼠源性生物制品及其生產(chǎn)原材料外源病毒必須排除項(xiàng)目[12]。

從ELISA抗體檢測結(jié)果和本文建立的Q-PCR方法檢測結(jié)果可知,40只SPF小鼠和58只裸鼴鼠檢測結(jié)果一致,均為陰性,說明送檢動物確實(shí)無SeV感染。5只清潔級小鼠經(jīng)ELISA檢測陽性率為40%,說明送檢小鼠確實(shí)存在SV的感染,同時也說明Q-PCR方法可以彌補(bǔ)因抗體在動物體內(nèi)存在的差異性而導(dǎo)致的ELISA抗體檢測方法漏檢,也進(jìn)一步證明建立的方法可以用于動物是否攜帶SeV的檢測。4只屏障飼養(yǎng)的黃鼠經(jīng)ELISA抗體檢測結(jié)果均為陰性,經(jīng)Q-PCR檢測結(jié)果均為陽性。分析其原因:①送檢黃鼠經(jīng)背景調(diào)查來源為野生,且為成年黃鼠,因此在屏障環(huán)境飼養(yǎng)前可能就已感染SeV;②由于抗原抗體在動物體內(nèi)存在的差異性,動物體內(nèi)可能一直攜帶病毒,但抗體水平已經(jīng)下降,抗體檢測結(jié)果可能會為陰性?，F(xiàn)在國內(nèi)對仙臺病毒檢測主要為ELISA方法,通過檢測血清中仙臺病毒抗體間接反映病毒感染情況,存在步驟煩瑣、耗時長、不能反映實(shí)時病毒感染狀態(tài)等缺點(diǎn),且藥典關(guān)于“鼠源性病毒檢查法”中仙臺病毒的檢測方法也僅局限于動物抗體產(chǎn)生、細(xì)胞接種和雞胚接種等方法[12]同樣存在檢測周期長、敏感性低等特點(diǎn)。本文建立的熒光定量PCR方法操作快捷、靈敏、特異[13-18],可以定量檢測樣本病毒拷貝數(shù)[19-22],不僅可以用于動物的檢測及反映動物感染狀態(tài),同時可以用于動物源性生物制品或生產(chǎn)原材料外源仙臺病毒因子的檢測,為用藥安全提供保障。

目前市場上商品化SeV核酸檢測商品化試劑匱乏。因此本實(shí)驗(yàn)建立的方法,不僅可以開展對小鼠、黃鼠、裸鼴鼠等動物及鼠源生物制品外源 SeV的檢測,為保證實(shí)驗(yàn)小鼠、黃鼠、裸鼴鼠等實(shí)驗(yàn)動物使用安全性及為實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)準(zhǔn)化研究提供依據(jù),同時也為試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。