羅兆莉 軒 冉 莘琳琳 孫其玉 董晏榕 任其奎 楊 帆 田兆菊

(1.山東第一醫(yī)科大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院,泰安 271016)(2.山東第一醫(yī)科大學(xué)/山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 第二附屬醫(yī)院,泰安 271016)

花粉是引起I型超敏反應(yīng)性疾病的重要致敏原之一,致敏花粉的種類因地區(qū)、海拔、季節(jié)的不同而有所不同[1]。柳樹是我國分布較廣的樹種,每年產(chǎn)生的花粉已成為春季主要的致敏原之一,常引起人類過敏性鼻炎的發(fā)作。目前,臨床上多采用口服抗組胺類藥物、同時鼻噴激素法治療過敏性鼻炎,有一定療效;但患者長期使用會引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng),

表現(xiàn)為頭暈、頭昏、嗜睡、乏力等[2]。特異性脫敏療法是目前唯一能因病治療過敏性疾病的方法[3],該方法可預(yù)防新出現(xiàn)的過敏原引起的超敏反應(yīng),防止過敏性鼻炎進(jìn)一步發(fā)展為哮喘。

目前,我國臨床成功應(yīng)用的第一種特異性脫敏治療制劑是塵螨滴劑,對其他過敏原引起的過敏性鼻炎的免疫治療還處于研究階段。為此,本研究建立了柳樹花粉過敏性鼻炎的小鼠模型,采用遞增變應(yīng)原劑量的方法給小鼠注射花粉過敏原,通過比較小鼠鼻部癥狀、檢查鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)以及血清中sIgE的含量變化[4],探索特異性脫敏療法對過敏性鼻炎的治療效果,為臨床防治過敏性鼻炎提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級健康昆明小鼠58只,雄雌隨機(jī),7周齡,體質(zhì)量(18±2)g,由山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)實驗動物中心提供。植物蛋白提取試劑盒(Cat#BC3720)為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;小鼠血清特異性sIgE酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒為上海廣銳生物科技有限公司產(chǎn)品;B-500超微量分光光度計為上海元析儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 柳樹花粉的采集及形態(tài)觀察:于2018年3月柳樹雄花成熟散粉時,采用自然脫落法收集花粉[5],室溫晾干后裝于1.5 mL離心管中,在-70℃冰箱中保存[6]。取少量花粉置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 柳樹花粉蛋白質(zhì)提取液的制備及濃度測定:取100～200 mg的柳樹花粉放入液氮中過夜,在液氮中將花粉研碎;加入 10μL的蛋白酶抑制劑、10μL的苯甲基磺酰氟(PMSF)和1 mL的細(xì)胞裂解液,4℃裂解20 min,期間每隔 5 min震蕩 1次;4℃,14 000 r/m in離心30 m in[7],取上清液[8]用超微量分光光度計進(jìn)行蛋白定量。

1.2.3 建立柳樹花粉引起的過敏性鼻炎小鼠模型[9]:將小鼠隨機(jī)分成實驗組和對照組。實驗組分為A、B、C、D四個小組,每組8只小鼠,對照組26只小鼠。將柳樹花粉蛋白提取液混懸于含5%氫氧化鋁的生理鹽水中[10],配成濃度為 1.5 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL和3.0 mg/mL的溶液。腹腔注射0.4 mL/只,對照組注射生理鹽水。實驗組和對照組均每間隔3 d重復(fù)注射1次,共7次;第 7次注射后的第6天開始對小鼠進(jìn)行滴鼻激發(fā)。實驗組和對照組小鼠均采用兩個濃度滴鼻,分別為10.6 mg/mL和16 mg/mL,10μL/只,每天 1 次,連續(xù)6 d。每次激發(fā)完成后30 min內(nèi),觀察小鼠打噴嚏、抓鼻等行為學(xué)癥狀[8]。

1.2.4 脫敏治療[11]:過敏性鼻炎的小鼠模型成功建立后,每隔5 d皮下注射柳樹花粉蛋白進(jìn)行特異性脫敏治療。實驗組采用柳樹花粉蛋白提取液進(jìn)行注射,起始治療階段有兩種濃度:0.16 mg/mL和1.6 mg/mL;維持治療階段一種濃度:1.6 mg/mL。起始治療第一階段每天注射1次,連續(xù)3 d,濃度為0.16 mg/mL,劑量依次為0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL;第二階段每天注射 1次,連續(xù) 3 d,濃度為1.6 mg/mL,劑量依次為 0.1 mL、0.3 mL、0.5 mL。維持治療階段從起始治療階段后的第7 d開始,每天注射1次,濃度為1.6 mg/mL,劑量為0.5 mL,維持治療5 d。對照組用生理鹽水進(jìn)行皮下注射,方法、劑量同實驗組。每次注射后30 min內(nèi)觀察小鼠的打噴嚏、流鼻涕、抓鼻等癥狀;取小鼠血液,分離血清,檢測血清中特異性sIgE的含量,采用安樂死的方法處死小鼠,取鼻黏膜進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.2.5 小鼠鼻部癥狀的觀察及評分[8]:根據(jù)小鼠癥狀,按照以下描述給小鼠計分:①打噴嚏。4個以內(nèi)1分;4～10個 2分;10個以上 3分。②抓鼻次數(shù)。輕度抓鼻(4次以內(nèi))1分;頻繁抓鼻(4～10次)2分;抓鼻不止(10次以上)3分。以疊加法記分,總分超過5分即為建模成功。

1.2.6 測定血清中特異性sIgE的含量[12]:小鼠尾靜脈采血[13],分離血清,用ELISA試劑盒測定血清中特異性sIgE的含量。

1.2.7 鼻黏膜病理學(xué)檢查[1]:用頸椎脫臼法處死部分小鼠,取雙側(cè)鼻腔組織,10%甲醛固定,石蠟包埋,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察鼻黏膜局部病理學(xué)變化。

1.3 統(tǒng)計方法

所有計量資料采用(±s)表示,采用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有計數(shù)資料差異性采用P＜0.05表示,差異的顯著性采用SPSS 22.0軟件中非參數(shù)檢驗來檢驗。

2 結(jié)果

2.1 柳樹花粉的形態(tài)

用顯微鏡觀察柳樹花粉的形態(tài),見圖1。

圖1 柳樹花粉(×400)Fig.1 Willow pollen(×400)

2.2 小鼠鼻部癥狀觀察及評分

實驗組小鼠可見頻繁抓鼻子并伴有打噴嚏癥狀,有的小鼠30 min內(nèi)噴嚏數(shù)可高達(dá)93次。小鼠打噴嚏、抓鼻等鼻部癥狀,見圖2。經(jīng)行為學(xué)評分后,實驗組小鼠有25只大于5分,空白組小鼠均小于5分,且具有統(tǒng)計學(xué)差異(z=-6.627,P＜0.05,非參數(shù)檢驗),由此可知建模成功。

2.3 小鼠鼻黏膜組織學(xué)檢查

取小鼠的鼻黏膜制作組織學(xué)切片,顯微鏡下觀察,空白組小鼠鼻黏膜中未見炎性細(xì)胞。實驗組中,用低濃度激發(fā)的小鼠,鼻黏膜中可見大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤,偶見漿細(xì)胞;高濃度激發(fā)的小鼠鼻黏膜中可見嗜酸性粒細(xì)胞,但比低濃度激發(fā)組少,比空白組多,說明低濃度的柳樹花粉蛋白提取液的激發(fā)效果更好,建立的過敏性鼻炎模型更典型。治療后小鼠鼻黏膜組織學(xué)切片中可見嗜酸性粒細(xì)胞明顯比治療前減少,并出現(xiàn)漿細(xì)胞,說明脫敏治療有效,見圖3。

圖2 小鼠激發(fā)后癥狀注:左側(cè)小鼠在滴鼻激發(fā)后出現(xiàn)搔鼻現(xiàn)象,同時出現(xiàn)打噴嚏癥狀(瞳孔縮小)Fig.2 Symptoms of mice after nasal stimulationNote:The mouse on the left side was scratching and sneezing after nasal stimulation(pupil reduction)

圖3 各組小鼠鼻黏膜顯微鏡檢查(HE染色,×400)注:A:空白組;B:實驗組(低濃度激發(fā));C:實驗組(高濃度激發(fā));D:治療組Fig.3 Microscopic examination of the nasal mucosa of mice in each group(HE staining,×400)Note:A:blank group;B:experimental group(low concentration stimulation);C:experimental group(high concentration stimulation);D:treatment group

2.4 小鼠血清特異性sIgE含量的測定

對小鼠血清中特異性sIgE含量進(jìn)行檢測,實驗組小鼠激發(fā)后血清特異性sIgE含量有升高的趨勢,脫敏治療后血清中sIgE含量有下降的趨勢,但是差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),見圖4。

圖4 實驗組小鼠各階段血清特異性sIgE含量變化Fig.4 Changes of serum specific sIgE levels in the experimental group at various stages

3 討論

過敏性鼻炎是一種常見病[14],現(xiàn)臨床上多采用口服抗組胺類藥、同時鼻噴激素進(jìn)行治療,有一定療效,但長期使用會導(dǎo)致不良反應(yīng),如過敏癥狀加重、激發(fā)輕型哮喘等?；ǚ凼且疬^敏性疾病的主要原因,目前特異性脫敏療法[15]是唯一能因病治療過敏性疾病的方法,該方法也可預(yù)防發(fā)生新過敏原的超敏反應(yīng)及防止過敏性鼻炎發(fā)展為哮喘,但是現(xiàn)在我國臨床成功應(yīng)用的第一種特異性脫敏治療制劑是塵螨滴劑,只針對塵螨的治療,對其他過敏原引起的過敏性鼻炎的免疫治療還處于研究階段。

鑒于此,本課題采用柳樹花粉來建立過敏性鼻炎的小鼠模型,旨在通過脫敏療法治療過敏性鼻炎,為臨床治療過敏性鼻炎提供一定的依據(jù)。本研究采集柳樹花粉、純化提取蛋白質(zhì),腹腔注射免疫小鼠、滴鼻激發(fā)小鼠。通過對小鼠鼻部癥狀觀察評分、光學(xué)顯微鏡觀察鼻黏膜局部病理學(xué)變化發(fā)現(xiàn),過敏原激發(fā)后,小鼠出現(xiàn)明顯抓鼻、打噴嚏、流鼻涕等癥狀,并且次數(shù)較多,鼻黏膜層充血增厚,炎性細(xì)胞浸潤,這些結(jié)果均表示成功建立柳樹花粉致敏的過敏性鼻炎小鼠模型。

成功建模后,通過遞增變應(yīng)原劑量的方法皮下注射小鼠,目的是使其產(chǎn)生免疫耐受,從而達(dá)到治療過敏性鼻炎的目的。通過動態(tài)監(jiān)測小鼠鼻部癥狀、鼻黏膜組織形態(tài)學(xué)變化,發(fā)現(xiàn)小鼠抓鼻和打噴嚏的次數(shù)逐漸減少直至消失、鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞逐漸減少[16],最后無炎性細(xì)胞浸潤,說明脫敏療法治療過敏性鼻炎是非常有效的一種方法。通過對小鼠血清中sIgE含量進(jìn)行檢測,我們發(fā)現(xiàn),雖然處理的各階段沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),但仍可以看到,實驗組小鼠激發(fā)后血清特異性sIgE的含量有升高的趨勢,脫敏治療后血清中 sIgE含量有下降的趨勢。由此推測,這可能是由于sIgE是微量抗體,血清含量的影響因素較多且不穩(wěn)定所致。

本實驗利用脫敏的原理,通過注射少量變應(yīng)原,誘導(dǎo)致敏細(xì)胞僅釋放微量活性介質(zhì),而不引起臨床癥狀,短時間內(nèi)多次注射,使致敏細(xì)胞內(nèi)活性介質(zhì)逐漸耗竭,從而消除機(jī)體致敏狀態(tài),成功使患過敏性鼻炎的小鼠得到免疫耐受。但由于臨床上難于確定脫敏階段變應(yīng)原的劑量以及抗原,限制了脫敏療法在臨床上的廣泛應(yīng)用。