馮育芳 邢 進(jìn) 張雪青 岳秉飛 趙德明

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100094)(2.中國(guó)食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所,北京 102629)

實(shí)驗(yàn)大鼠在生物醫(yī)學(xué)中應(yīng)用廣泛,一直是生理、行為、代謝、神經(jīng)、毒理等研究最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一[1-3]。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,以下簡(jiǎn)稱金葡菌)是一種廣泛分布的細(xì)菌,其在空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到。金葡菌也是一類病原菌,特定條件下可引起人類或動(dòng)物多種感染,包括局部化膿性疾病和全身化膿性疾病[4]。值得特別注意的是,新出現(xiàn)的耐甲氧西林金葡菌(MRSA),被稱作超級(jí)細(xì)菌,幾乎能抵抗所有的抗生素,成為人們關(guān)注的重點(diǎn)[5]。鑒于金葡菌的廣泛性、潛在致病性及耐藥性,Jackson Lab和Charles River要求大鼠檢測(cè)并排除該細(xì)菌,日本石中研則要求免疫缺陷大鼠必須檢測(cè)并排除該細(xì)菌,我國(guó)國(guó)標(biāo)也要求SPF大鼠必須排除[6-7]。因此,本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌的攜帶情況,并分析其分子特征,探尋其流行趨勢(shì),為實(shí)驗(yàn)大鼠金黃色葡萄球菌的防控提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受檢動(dòng)物:受檢 SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠來(lái)自北京市12家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用機(jī)構(gòu)。

1.1.2 所用試劑:培養(yǎng)基包括甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司,11316)、哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(OXIOD公司,CM0331B)、脫纖維羊血(北京陸橋公司,P62)、生化鑒定試劑為BD陽(yáng)性菌鑒定板(BD公司,448008),DNA提取試劑盒(QIAGEN,69506),Prime STAR HS(TAKARA,R040A),瓊脂糖(TAKARA,5260)。

1.1.3 儀器設(shè)備:恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific Heraeherm)、生物安全柜(Thermo Scientific A2)、顯微鏡(Nikon)、細(xì)菌鑒定儀(BD Phonix-100)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集:觀察實(shí)驗(yàn)大鼠外觀,核對(duì)動(dòng)物編號(hào)。斷頸處死動(dòng)物,將動(dòng)物仰臥固定,消毒解剖部位。在動(dòng)物下腹部皮膚剪開一小口,剝開皮膚層后剪開肌肉,將回盲部剪開,取適量?jī)?nèi)容物接種高鹽甘露醇瓊脂平皿(SP)。

1.2.2 金葡菌的檢測(cè):將已接種的SP培養(yǎng)基置(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h。在 SP培養(yǎng)基上形成1 mm左右、凸起、黃色的菌落,菌落周圍的培養(yǎng)基由紅色變成黃色。轉(zhuǎn)種血瓊脂平皿(36±1)℃培養(yǎng)18～24 h形成白色或金黃色、凸起、圓形、不透明、表面光滑的菌落。革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌,排列成葡萄狀,無(wú)芽孢,無(wú)莢膜,直徑約為 0.5～0.1μm。 直接用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定,或參照國(guó)標(biāo)進(jìn)行手工生化鑒定。結(jié)合培養(yǎng)形態(tài)、染色以及生化鑒定結(jié)果,做出判定。

1.2.3 MLST分型:多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence typing,MLST)實(shí)驗(yàn)按照金葡菌MLST網(wǎng)站(http://saureus.mLst.net)提供的方法進(jìn)行。參照網(wǎng)站的方法合成引物。PCR反應(yīng)體系為總體積50μL,其中包含 H2O 19μL、2×PCR mix 25μL、上游引物2μL、下游引物2μL、DNA 模板 2μL。 PCR反應(yīng)條件為98℃10 s、55℃5 s、72℃1 min,共30個(gè)循環(huán)。PCR后用1.5%瓊脂糖電泳鑒定有無(wú)擴(kuò)增條帶。符合目標(biāo)長(zhǎng)度的陽(yáng)性條帶產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì),獲得等位基因號(hào)和ST型。數(shù)據(jù)錄入BioNumerics 7.1軟件構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果

2.1 北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌的流行趨勢(shì)

為了解北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌的流行趨勢(shì),本實(shí)驗(yàn)室按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)持續(xù)對(duì)北京地區(qū)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行抽檢,2008—2017年,每年檢測(cè)大鼠106～288只,總計(jì) 1956只。檢測(cè)結(jié)果顯示,每年檢出金葡菌陽(yáng)性大鼠6～39只,總計(jì)165只;每年金葡菌陽(yáng)性率為3.17%～18.48%,平均陽(yáng)性率為8.44%,見表1。金葡菌整體陽(yáng)性率呈先低中高后低的趨勢(shì),在2013年金匍菌大鼠陽(yáng)性數(shù)量和陽(yáng)性率最高,達(dá)到39只和占比18.48%,見圖1。進(jìn)一步分析金葡菌大鼠檢測(cè)的時(shí)間分布,結(jié)果發(fā)現(xiàn)第四季度檢測(cè)率最高,但各季節(jié)之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果說(shuō)明,金葡菌在北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠中長(zhǎng)期廣泛存在,2013年達(dá)到陽(yáng)性峰值,之后陽(yáng)性率呈逐年下降趨勢(shì),陽(yáng)性率在季節(jié)間的差異不大,見圖2。

表1 2008—2017年北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌的檢出情況Table 1 Detection of Staphylococcus aureus in laboratory rats in Beijing from 2008 to 2017

圖1 2008—2017年北京大鼠金葡菌的流行趨勢(shì)圖Fig.1 Epidemiological Trend of Staphylococcus aureus in laboratory rats in Beijing from 2008 to 2017

2.2 實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌的mLST分型

圖2 2008—2017年北京大鼠金葡菌的流行趨勢(shì)圖(分季度)Fig.2 2008—2017 Epidemiological Trend of Staphylococcus aureus in laboratory rats in Beijing(Quarterly)

為了解實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌的分子特征,本實(shí)驗(yàn)室對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠來(lái)源的148株金葡菌進(jìn)行了 MLST分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn),148株菌株共分為7個(gè) ST型別,分別為 ST8、ST3、ST1、ST6、ST2871、ST88、及 ST641,每個(gè)ST型包含菌株數(shù)1～76株不等。從構(gòu)成比來(lái)看,ST1占比最大,達(dá)到 51.35%(76株);其次是ST2871,占比達(dá)到30.41%(45株);其余 ST型別占比都小于10%,見表2。從進(jìn)化上來(lái)看,ST1和ST88屬于其中的中間環(huán)節(jié),見圖3。在此基礎(chǔ)上,分析不同ST型別在流行時(shí)間上的區(qū)別。結(jié)果發(fā)現(xiàn),2012年之前和2016年ST1占主要位置;2012—2016年,ST2871占比突然增大;2017—2018年ST6占比逐漸升高,占據(jù)主要位置,見圖4。分析不同 ST型別在實(shí)驗(yàn)空間上的區(qū)別,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ST1主要流行于A～F、J、M 等八個(gè)機(jī)構(gòu),ST2871 則在 J、H、I等三個(gè)機(jī)構(gòu)占主要地位,見圖5。這些結(jié)果說(shuō)明,北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌具有顯著的時(shí)空分布特點(diǎn),以及進(jìn)化相關(guān)性。

表2 148株金黃色葡萄球菌mLST分析結(jié)果Table 2 mLST analysis of 148 strains Staphylococcus aureus

圖3 金黃色葡萄球菌mLST結(jié)果的聚類樹Fig.3 Cluster tree of staphylococcus aureus by mLST analysis

圖4 金黃色葡萄球菌型別流行時(shí)間分布Fig.4 Time distribution of Staphylococcus aureus by types

3 結(jié)論

圖5 金葡菌各型別的空間分布Fig.5 Spatial distribution of Staphylococcus aureus by types

金葡菌是人類的一種重要病原菌,屬于葡萄球菌屬,有“嗜肉菌”的別稱,是革蘭陽(yáng)性菌的代表。金葡菌在自然界中無(wú)處不在,空氣、水、灰塵及人和動(dòng)物的排泄物中都可找到,人體和動(dòng)物受到污染的機(jī)會(huì)很多[8]。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告,由金葡菌引起的感染占第二位,僅次于大腸桿菌。

為排除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的金葡菌,首先要了解其感染情況,2012年葛文平等[9]檢測(cè)了5個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)不同品系SPF級(jí)小鼠,發(fā)現(xiàn)其金葡菌的攜帶率為1.875%。丁浛高等[10]在揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心13個(gè)隔離設(shè)施發(fā)現(xiàn)部分小鼠攜帶金黃色葡萄球菌。黃偉峰等[11]于2011—2017年從7家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)采集完成370只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的金葡菌檢測(cè),共檢出金葡菌31株,總分離率為 12.16%,且均從 SPF大鼠中分離所得。本研究檢測(cè)了2008—2017年北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠1 956只,檢測(cè)到陽(yáng)性大鼠165只,陽(yáng)性率為8.44%,說(shuō)明金葡菌在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣泛長(zhǎng)期存在,特別是在實(shí)驗(yàn)大鼠群體中,需要特別重視。

分子流行病學(xué)可為病原防控提供策略和措施。黃偉峰等[11]從實(shí)驗(yàn)大鼠中檢出金葡菌分成5個(gè)型別,其中 T2360為優(yōu)勢(shì)型別,PFGE型別有10個(gè)帶型;而且飼養(yǎng)環(huán)境中金葡菌的PFGE帶型與2017年SPF大鼠中的細(xì)菌帶型完全一致,說(shuō)明飼養(yǎng)環(huán)境中存在的金葡菌與SPF大鼠感染的金葡菌具有緊密聯(lián)系[12]。文獻(xiàn)報(bào)道Charles River實(shí)驗(yàn)室99株金葡菌大部分屬于 ST88(54.5%),隨后是 ST15、ST5、ST188及ST8[13]。本研究對(duì)北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠分離到的148株金葡菌進(jìn)行了MLST分型檢測(cè),結(jié)果顯示,北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠的金葡菌以ST1為主,其次是ST2871,與國(guó)外及國(guó)內(nèi)現(xiàn)有結(jié)果均不同。說(shuō)明北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠的細(xì)菌來(lái)源因?yàn)榈赜蚧蛉藛T引入,需要從這些角度進(jìn)行防控,確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量[14]。

綜上所述,本研究長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)了北京地區(qū)實(shí)驗(yàn)大鼠的流行趨勢(shì),首次使用MLST分型分析國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)大鼠金葡菌的分子特征,為實(shí)驗(yàn)大鼠金黃色葡萄球菌的防控提供了基礎(chǔ)信息,為實(shí)驗(yàn)大鼠金黃色葡萄球菌的檢測(cè)提供數(shù)據(jù)支持,從而保障實(shí)驗(yàn)大鼠的微生物質(zhì)量。