陳夢妍，謝 佳，田 麗，皮會豐

(陸軍軍醫(yī)大學軍事預(yù)防醫(yī)學系軍隊勞動衛(wèi)生學教研室/電磁輻射醫(yī)學防護教育部重點實驗室，重慶 400038)

鎘被廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，包括冶煉、采礦、電鍍、油漆顏料生產(chǎn)以及合金制造等[1]。但鎘是一種對人體多個器官具有危害的重金屬，“湖南鎘大米事件”“河南鎘小麥事件”等重大公共衛(wèi)生事件的披露揭示了鎘污染的嚴峻現(xiàn)實及其對公眾健康的巨大威脅[2]。肝是鎘毒理作用的主要靶器官之一，導致肝功能異常的人群鎘暴露主要是急性暴露[3]。在鎘的急性中毒事件中，患者會出現(xiàn)倦怠、惡心等癥狀和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase,AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)等酶譜異常[4]。因此，探究鎘誘導的肝損傷分子機制，可以為鎘導致的肝損傷防護提供新線索。

自噬是細胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要過程，某些衰老細胞器和生物大分子等由雙層膜包裹后陷入溶酶體內(nèi)并被消化掉是維持細胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素之一[5]。自噬-溶酶體途徑受損會導致細胞凋亡因子的釋放和壞死信號的啟動，造成細胞的損傷或死亡。然而，細胞自噬過度活化會導致細胞內(nèi)正常的線粒體被吞噬降解，引起細胞能量代謝障礙，從而刺激細胞自噬性死亡[6]。本課題組前期研究結(jié)果表明，肝細胞(L02細胞和HepG2細胞)在鎘暴露后會出現(xiàn)SQSTM1蛋白減少和LC3蛋白翻轉(zhuǎn)實驗陽性，敲除自噬關(guān)鍵基因ATG5和利用自噬抑制劑3-MA可以顯著減少鎘暴露誘導的線粒體降解、能量代謝障礙及肝細胞死亡，提示鎘暴露造成了肝細胞自噬過度活化，抑制自噬能顯著拮抗鎘肝毒性[7-8]。然而，鎘是通過何種信號通路誘導自噬還有待進一步闡明。

ZKSCAN3是控制細胞自噬-溶酶體途徑的關(guān)鍵分子之一，主要通過調(diào)控自噬-溶酶體途徑相關(guān)基因表達從而控制自噬流[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，ZKSCAN3位于細胞核中，但在饑餓或者運動等應(yīng)激情況下，細胞核內(nèi)的ZKSCAN3會減少或向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，從而喪失對DNA轉(zhuǎn)錄的抑制作用，進而啟動自噬-溶酶體途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[9-10]?；谝陨锨闆r，本研究通過體內(nèi)實驗，建立急性鎘暴露小鼠模型，初步探究ZKSCAN3介導的自噬在急性鎘暴露肝損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

SPF級C57BL/6J雄性小鼠，7～8周齡，由陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)20170002，使用許可證號：SYXK(渝)20170002。所有動物實驗的開展均獲得陸軍軍醫(yī)大學實驗動物倫理審查委員會批準。氯化鎘購自西格瑪奧德里奇公司，純度大于99.99%。建立鎘暴露小鼠模型前，以生理鹽水配制氯化鎘溶液，質(zhì)量體積比為1∶2.5。

1.2 小鼠急性氯化鎘暴露實驗

將16只8周齡SPF級雄性小鼠隨機分成生理鹽水對照組及鎘暴露組，每組8只。生理鹽水對照組小鼠每日腹腔注射等量生理鹽水1次，7 d后取材進行后續(xù)實驗；鎘暴露組小鼠腹腔注射氯化鎘，染毒劑量為2 mg·kg-1·bw-1，染毒方式為每天腹腔注射1次，7 d后取材進行后續(xù)實驗[11]。

1.3 AAV-TBG-ZKSCAN3干預(yù)實驗

AAV-TBG-ZKSCAN3及AAV-TBG-control兩種腺相關(guān)病毒由和元生物設(shè)計合成，該病毒含有TBG啟動子，可以在肝中特異性過表達ZKSCAN3[12]。24只7周齡SPF級雄性小鼠隨機分成鎘組、鎘+ZKSCAN3組、對照組，每組8只：鎘組尾靜脈注射AAV-TBG-control，1周后連續(xù)腹腔注射氯化鎘7 d；鎘+ZKSCAN3組尾靜脈注射AAV-TBG-ZKSCAN3，1周后連續(xù)腹腔注射氯化鎘7 d；對照組尾靜脈注射AAV-TBG-control，1周后連續(xù)腹腔注射生理鹽水7 d。2×1011拷貝數(shù)AAV溶解在100 μL生理鹽水后進行尾靜脈注射。氯化鎘染毒劑量為2 mg·kg-1·bw-1，染毒方式為每天腹腔注射1次，7 d后取材進行后續(xù)實驗。

1.4 血清生化指標檢測

鎘暴露實驗及干預(yù)實驗完成后，小鼠以25%烏拉坦麻醉，心臟取血，1 000 g離心10 min，制備血清，于-80 ℃凍存。干冰運輸送至武漢賽維爾生物科技有限公司以全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST含量。

1.5 肝組織病理形態(tài)學檢查

鎘暴露實驗及干預(yù)實驗完成后，小鼠以25%烏拉坦麻醉，取肝組織，大小為0.5 cm×1 cm×1.5 cm，4%多聚甲醛固定，送至武漢賽維爾生物科技有限公司進行肝組織常規(guī)病理切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，應(yīng)用Pannoramic MIDI病理切片掃描儀進行記錄。

1.6 肝組織的細胞核與細胞質(zhì)蛋白分離

采用碧云天的細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒進行蛋白的核質(zhì)分離。鎘暴露實驗結(jié)束后采集小鼠肝組織，用剪刀將組織盡可能剪小，按照20∶1的比例混合適量的細胞漿蛋白抽提試劑A和B。每60 mg組織加入200 μL組織勻漿液后，在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。隨后按照說明書分別提取細胞質(zhì)蛋白及細胞核蛋白。

1.7 Western blot檢測ZKSCAN3蛋白表達

將細胞核蛋白與細胞質(zhì)蛋白分別上樣，上樣量為50 μg，用10% SDS PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后用10%脫脂奶粉溶液封閉1 h，TBST液清洗，然后加入一抗(ZKSCAN3，1∶1 000；GAPDH，1∶5 000；H3，1∶5 000)。孵育過夜后加入相應(yīng)二抗。使用ECL顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，觀測結(jié)果，用Image J軟件分析條帶圖。

1.8 實時熒光定量PCR檢測自噬相關(guān)基因mRNA表達

以總RNA提取試劑RNAiso Plus(寶生物，日本)溶解小于100 mg的肝組織，按說明書步驟提取樣本總RNA。取等量總RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT reagent Kit(寶生物，日本)說明書步驟將總RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA以進行后續(xù)實驗。使用熒光定量檢測試劑SYBR Master Mix(寶生物，日本)及熒光定量PCR儀(CFX96，美國伯樂)進行基因?qū)崟r定量熒光PCR實驗，檢測自噬成膜、發(fā)生、延伸等過程的基因Map1lc3b，控制自噬小體與溶酶體融合的基因Rab5a，溶酶體v-ATPase酶基因Atp6v0d1，溶酶體膜蛋白酶基因Lamp1和溶酶體水解酶基因Ctsb的表達。以β-actin為內(nèi)參，以2-ΔΔCT方法計算mRNA表達量[13]，參照對照組計算相關(guān)基因mRNA相對表達水平。特異性引物序列見表1。

表1 基因引物列表

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 急性鎘暴露誘導小鼠肝損傷

HE染色結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組比較，鎘暴露組小鼠肝細胞局部出現(xiàn)氣球樣變，炎癥細胞浸潤、壞死(圖1a)；與生理鹽水對照組比較，鎘暴露組小鼠血清中肝功能生化指標ALT、AST顯著較高(P<0.01)，見圖1b、c，表明2 mg·kg-1·bw-1急性鎘暴露可造成小鼠肝損傷。

2.2 鎘暴露后肝自噬相關(guān)基因mRNA表達顯著增高

實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與生理鹽水對照組比較，鎘暴露組肝組織中Map1lc3b、Rab5a、Atp6v0d1、Lamp1、Ctsb的mRNA表達均顯著較高，差異有極顯著性統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

2.3 鎘暴露抑制ZKSCAN3 mRNA和蛋白的表達

本研究檢測發(fā)現(xiàn)，與生理鹽水對照組比較，鎘暴露組ZKSCAN3基因表達顯著較少(P<0.01)，見圖3a。同時，本課題組進一步檢測ZKSCAN3蛋白在鎘暴露后是否發(fā)生細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，結(jié)果顯示，鎘暴露降低了細胞核內(nèi)ZKSCAN3蛋白的表達(P<0.01)，卻并未引起其明顯的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位(P>0.05)，見圖3b。

2.4 過表達ZKSCAN3可抑制鎘誘導的肝細胞自噬相關(guān)基因mRNA的表達

本研究檢測發(fā)現(xiàn)，過表達ZKSCAN3可以扭轉(zhuǎn)鎘對ZKSCAN3基因mRNA的抑制(P<0.05)，見圖4a；過表達ZKSCAN3可以顯著抑制鎘誘導的Map1lc3b、Rab5a、Atp6v0d1、Lamp1、Ctsb等自噬相關(guān)基因mRNA的表達(P<0.01)，見圖4b～e。

a：小鼠肝組織HE染色圖；b：AST水平；c：ALT水平 *：與生理鹽水對照組相比，P<0.01圖1 急性鎘暴露對小鼠肝組織形態(tài)的影響及血清生化指標分析

a：Map1lc3b；b：Rab5a；c：Atp6v0d1；d:Lamp1；e: Ctsb *：與生理鹽水對照組比較，P<0.01圖2 急性鎘暴露肝組織中自噬相關(guān)基因mRNA表達

a：ZKSCAN3基因表達；b：ZKSCAN3蛋白的核質(zhì)分布 *：與生理鹽水對照組比較，P<0.01圖3 鎘暴露抑制ZKSCAN3蛋白的表達

a：ZKSCAN3；b：Map1lc3b；c：Rab5a；d：Atp6v0d1；e: Lamp1；f: Ctsb *：與對照組比較，P<0.01；#：與鎘組比較，P<0.05；△：與鎘組比較，P<0.01圖4 過表達ZKSCAN3對自噬相關(guān)基因mRNA表達影響

2.5 過表達ZKSCAN3可以抑制鎘誘導的肝損傷

HE染色結(jié)果顯示，過表達ZKSCAN3可顯著減少鎘組小鼠肝組織炎癥細胞浸潤，減輕局部肝細胞氣球樣變、壞死(圖5a)；與鎘組比較，鎘+ZKSCAN3組小鼠血清中肝功能生化指標ALT、AST顯著較低(P<0.01)，見圖5b、c。

a：小鼠肝組織形態(tài)學；b：血清生化指標AST水平；c：血清生化指標ALT水平 *：與對照組比較，P<0.01；#：與鎘組比較，P<0.01圖5 過表達ZKSCAN3對急性鎘暴露誘導的小鼠肝損傷的影響

3 討論

肝是鎘中毒的主要靶器官之一，目前國內(nèi)外研究表明，鎘導致的肝毒性主要機制包括：改變維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定相關(guān)的某些基因表達；競爭性地抑制細胞膜上的各種離子通道，導致細胞內(nèi)離子代謝特別是鐵代謝的紊亂；改變線粒體膜通透性，誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及活性氧產(chǎn)生，促進凋亡及壞死[14-15]。盡管鎘肝毒理機制已經(jīng)有了一定進展，但是其作用機制依然缺乏系統(tǒng)的研究。本研究建立急性鎘暴露小鼠模型，發(fā)現(xiàn)2 mg·kg-1·bw-1鎘暴露 7 d可顯著誘導小鼠肝損傷，且ZKSCAN3介導的自噬與鎘肝毒性密切相關(guān)。

自噬-溶酶體途徑是細胞維持穩(wěn)態(tài)的重要生命過程，其基本過程包括自噬小泡的形成，自噬小體的組裝、延伸和閉合，自噬小體與溶酶體的融合，及隨后的包裹物在溶酶體水解酶的作用下降解，從而為細胞重新合成細胞器提供氨基酸等小分子原料[16]。在正常生理條件下，自噬可維持肝細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，自噬過度活化可導致肝細胞內(nèi)細胞器損傷及肝細胞死亡[17]。細胞自噬性死亡與很多化合物的毒理機制密切相關(guān)[18]。Feng等[19]研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡能夠顯著誘導大鼠原代神經(jīng)元自噬過度活化，導致神經(jīng)元線粒體拷貝數(shù)下降、線粒體供能障礙、ATP水平下降，從而產(chǎn)生神經(jīng)毒性。Su等[20]研究發(fā)現(xiàn)，自噬關(guān)鍵基因ATG7si-RNA通過抑制過度活化的自噬可以顯著拮抗1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶引起的神經(jīng)細胞死亡。本課題組前期研究結(jié)果已經(jīng)在細胞層面證實了鎘可以誘導肝細胞自噬過度活化。同時，Hao等[21]報道了鎘暴露可以誘導hsa_circ_0040768介導的肝細胞自噬性死亡。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn),鈣紊亂介導肝細胞自噬性死亡是鎘肝毒性的重要靶點。本課題組前期研究也證明了鎘暴露通過激活Ca2+-DNM1lL通路和抑制SIRT1-SIRT3-SOD2通路誘導肝細胞自噬性死亡[7-8]。本研究結(jié)果表明，鎘暴露可以激活肝細胞自噬-溶酶體相關(guān)基因的表達，為鎘誘導肝細胞自噬活化增添了體內(nèi)研究證據(jù)。

ZKSCAN3是一個具有KRAB與SCAN結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，KRAB結(jié)構(gòu)域結(jié)合到DNA模板時可起到轉(zhuǎn)錄抑制的作用，SCAN結(jié)構(gòu)域在C2H2鋅指蛋白的組裝與功能發(fā)揮上起到重要作用，而C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域可結(jié)合DNA、RNA、蛋白及小分子物質(zhì)，且不同的鋅指序列及鋅指間連接序列決定了該鋅指蛋白的結(jié)合特異性[23]。細胞核ZKSCAN3減少會啟動包括自噬成膜、自噬小體發(fā)生及成熟、自噬小體與溶酶體融合、溶酶體生成等一系列基因的表達，幾乎涵蓋了對整個自噬-溶酶體途徑的調(diào)控[24]。Lei等[25]報道了A30P突變的α-突觸核蛋白通過增加ZKSCAN3蛋白的表達抑制神經(jīng)細胞的自噬流。同樣有研究表明，HEP14化合物能誘導ZKSCAN3細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，促進細胞自噬，加強蛋白的降解和脂滴的代謝[10]。目前有研究顯示ZKSCAN3的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位與其磷酸化水平密切相關(guān)[26]。本研究發(fā)現(xiàn)鎘暴露抑制了ZKSCAN3蛋白的表達，但未引起其細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位，可能與其磷酸化水平?jīng)]有發(fā)生改變有關(guān)。然而過表達ZKSCAN3顯著抑制了自噬-溶酶體基因的表達，這也證實了是ZKSCAN3的表達而不是其細胞質(zhì)轉(zhuǎn)位參與了鎘誘導的急性肝損傷和細胞自噬性死亡。此外，最近有研究發(fā)現(xiàn)ZKSCAN3還可以通過保持異染色質(zhì)的穩(wěn)定性來拮抗細胞的衰老與死亡，而且這種功能并不依賴于對自噬的調(diào)控[27]。因此，ZKSCAN3在鎘肝毒性中的作用值得進一步的探討與研究。

綜上所述，急性鎘暴露可誘導小鼠肝細胞自噬性死亡，ZKSCAN3可能是鎘誘導肝細胞自噬性死亡的重要靶點。本研究探討了鎘肝毒理作用的細胞靶點及分子機制，為開展鎘肝毒性治療和藥物的研究提供了實驗依據(jù)。