★ 張玉愛 張禮芳 李昕穎,2 郭智強 廖太祥（.南昌市博澤康醫(yī)藥科技有限公司 南昌330029；2.南昌大學 南昌 330029）

復方黃芪顆粒的處方由防風、金銀花、首烏藤、黃芩、黃芪、薏苡仁等16 味中藥材組成，其主要功效為益氣滲濕，清熱涼血，用于治療風濕熱相搏，客于肌膚之濕疹、玫瑰糠疹、藥物性皮炎、接觸性皮炎、多形紅斑、結節(jié)性紅斑等病癥。原中藥處方?jīng)]有固定的質量標準，很難對藥品質量進行控制，為了有效在臨床中安全的應用和推廣，因此有必要進行相關的醫(yī)院制劑質量標準研究。

本文對該顆粒進行質量標準研究，通過TLC法對處方中的首烏藤、黃芪和黃芩進行定性鑒別，并以黃芩苷為定量指標，用HPLC 法測定該成分的方法并進行方法學考察，最終建立了復方黃芪顆粒的質量標準，保證臨床用藥的安全、有效和穩(wěn)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器KQ2200DB 型超聲波清洗機（昆山超聲波儀器有限公司）；ZF-2 型紫外儀（上海安亭電子儀器廠）；BS25S 型電子天平（德國賽多利斯儀器有限公司，d=0.01 mg）；LC-10AT 型高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津公司）；硅膠G 板（青島海洋化工廠）。

1.2 材料大黃素對照品（批號：110756-200110），黃芪甲苷對照品（批號：110781-201717），黃芩苷對照品（110715-200815），以上均購自中國藥品生物制品檢定研究院。首烏藤是蓼科植物何首烏的干燥藤莖；黃芩是唇形科植物黃芩的干燥根；黃芪是豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。復方黃芪顆粒供試品三批（170508、170511、170514）及陰性樣品均由本公司自制。甲醇為色譜純；水為超純水（自制）；其它化學試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 首烏藤的薄層色譜鑒別首烏藤中的主要化學成分為大黃素［1］。①供試品溶液的配制：取本品20 g，研細，加硅藻土5 g，研勻，加鹽酸和水各5 mL，攪勻，再加乙酸乙酯50 mL，振搖15 min，超聲處理45 min，取出，濾過，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。②對照品溶液的配制：另取大黃素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。③陰性溶液的配制：取缺首烏藤藥材的復方黃芪顆粒內(nèi)容物20 g，按供試品溶液制備的方法制成首烏藤陰性對照品溶液。④薄層色譜鑒別條件：照2015 版《中國藥典》薄層色譜法（第四部通則0502）試驗［2］，使用定量點樣毛細管吸取上述供試品溶液、對照品溶液、陰性對照溶液各10 μL，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷－乙酸乙酯－甲酸（60∶20∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于日光燈下檢視。⑤結果：供試品色譜中，在與對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照溶液色譜無上述斑點檢出。說明本法專屬性強，可以作為首烏藤的鑒別。

圖1 首烏藤薄層鑒別圖譜

2.1.2 黃芪中黃芪甲苷的薄層色譜鑒別黃芪中的主要化學成分為黃芪甲苷［3］。①供試品溶液的配制：取本品10 g，研細，加甲醇40 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液加在中性氧化鋁柱（100～120 目，10 g，內(nèi)徑為10-15 mm）上，用40 %甲醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水30 mL 使溶解，用水飽和正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，用20 mL 水洗滌2 次，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。②對照品溶液的配制：另取黃芪甲苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作為對照品溶液。③黃芪陰性對照溶液的配制：再取缺黃芪藥材的復方黃芪顆粒內(nèi)容物10g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照2015 版《中國藥典》薄層色譜法（第四部通則0502）試驗［2］，使用定量點樣毛細管吸取上述對照品溶液2 μL，供試品溶液10 μL，陰性對照品溶液10 μL 分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加熱至斑點顯色清晰。⑤結果：在紫外365 nm 下檢視，在與對照品溶液色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照溶液色譜中，無上述斑點檢出。說明本法專屬性強，可以作為黃芪的鑒別。

圖2 黃芪薄層鑒別圖譜

2.1.3 黃芩中黃芩苷的薄層色譜鑒別黃芩中的主要化學成分為黃芩苷［4］。①供試品溶液的配制：取本品10 g，研細，加5 %甲酸甲醇溶液30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水20 mL 使溶解，用20 mL 乙酸乙酯萃取2 次，合并乙酸乙酯溶液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。②對照品溶液的配制：另取黃芩苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液，作為對照品溶液。③黃芩陰性對照溶液的配制：再取缺黃芩藥材的復方黃芪顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照2015 版《中國藥典》薄層色譜法（第四部通則0502）試驗［2］，使用定量點樣毛細管吸取上述供試品溶液10 μL、對照品溶液5 μL，陰性對照品溶液10 μL 分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水（5∶3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鐵乙醇溶液。⑤結果：供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點；陰性對照品溶液色譜中，無上述斑點檢出。說明本法專屬性強，可以作為黃芩的鑒別。

圖3 黃芩薄層鑒別圖譜

2.2 黃芩苷的含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗［2］色譜條件：島津高效液相色譜儀；PolyPak TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為甲醇-0.2 %磷酸溶液（47∶53）；柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，進樣量為10 μL。在此色譜條件下，供試品中的黃芩苷與其他成分有較好的分離度，陰性樣品對指標成分含量測定無干擾。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備精密稱取適量的黃芩苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含黃芩苷約40 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備取本品適量，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入70 %乙醇溶液20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70 %乙醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備按處方比例，稱取缺少黃芩的復方黃芪顆粒的藥材，按照制備工藝配制，然后依照“2.2.3”項下的方法制備陰性對照溶液。

2.2.5 線性關系考察精密稱取黃芩苷對照品45 mg，置50 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.9 mg/mL 的對照品貯備液。再分別精密吸取對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液，分別進樣10 μL，按以上色譜條件測定，記錄色譜圖，以測定濃度X（mg/mL）對峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程為Y=4×106X-6 476.5，r=0.9999（n=7），試驗結果表明黃芩苷在0.045 69 mg/mL～0.913 9 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗精密吸取同一對照品溶液10 μL,按照“2.2.1”項下色譜條件，重復進樣6 次，記錄峰面積，結果對照品溶液峰面積RSD=0.31%（n=6），表明該儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗分別精密稱取同一批樣品約1 g（批號170508）6 份，按照供試品溶液制備方法制備，依法測定樣品中黃芩苷的含量，結果6 份黃芩苷的含量分別為1.303，1.320，1.327，1.311，1.315，1.319 mg/g，平均含量為1.316 mg/g，RSD為0.62%（n=6），表明該方法在同一條件下重復性好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗取裝量差異項下的本品內(nèi)容物（批號：170508）約1.0g，精密稱定，按照“2.2.3”項下方法制備供試液，室溫放置，在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h 分別吸取10 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果峰面積的RSD 為0.25%，表明24 h 內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.2.9 加樣回收率取同一批次項下的顆粒，研細，取約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入黃芩苷對照品溶液（0.507 1 mg/mL）1 mL，按含量測定方法項下供試品溶液的制備方法制備供試品溶液進行測定，平行6 份，計算回收率。

表1 黃芩苷回收率試驗結果

2.2.10 樣品含量測定分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，按外標法計算3 批中試樣品含量，三批中試樣品（170508、170511、170514）含量分別為1.331 mg/g、1.352 mg/g、1.313 mg/g。

3 討論

3.1 專屬性考察本試驗對處方中的金銀花、黃連、首烏藤、黃芪和黃芩等進行了薄層鑒別條件摸索，發(fā)現(xiàn)在本實驗色譜條件下，金銀花、黃連等均有陰性干擾，首烏藤、黃芪和黃芩供試品色譜與對照藥材和對照品色譜相應的位置上顯相同的顏色斑點，陰性樣品無干擾。因此確定了首烏藤、黃芪和黃芩作為薄層鑒別方法，重現(xiàn)性好，結果可靠。

3.2 檢測波長的選擇采用二極管陣列檢測器對黃芩苷對照品色譜峰進行光譜掃描，結果黃芩苷在280 nm 波長處有最大吸收，由于280 nm 雜峰對目標峰干擾少且穩(wěn)定，故選擇280 nm 作為檢測波長。

3.3 提取方法的選擇對加水量、提取時間、提取次數(shù)進行了摸索及確定，進行了三因素三水平正交實驗，結果表明，提取次數(shù)對提取工藝影響最大，其次是加水量，提取時間對提取工藝影響較小。從經(jīng)濟成本、實際生產(chǎn)考慮，確定本品提取最佳工藝條件為：加水量為8 倍，提取時間為2 h，提取次數(shù)為2 次。

3.4 制劑工藝的選擇日常生產(chǎn)過程中，中藥顆粒劑一般采用蔗糖作為矯味劑，糊精、淀粉作為粘合劑，我們分別對其進行了考察，并以溶化性作為參考依據(jù)，結果發(fā)現(xiàn)蔗糖加糊精，溶化完全，無分層現(xiàn)象；蔗糖加淀粉，溶化性不好，出現(xiàn)少量分層現(xiàn)象。故根據(jù)實驗結果，采用蔗糖、糊精作為制劑成型輔料。

3.5 色譜條件的優(yōu)化本實驗通過摸索乙腈與0.2 %磷酸水溶液、甲醇與0.2 %磷酸水溶液以及甲酸與0.2 %磷酸水溶液按一定比例混合作為流動相，考察其分離度，結果以甲醇-0.2 %磷酸溶液（47∶55）為流動相，流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃、PolyPak TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）的色譜條件下供試品中黃芩苷與其他共存組分峰能達到良好的分離。

本實驗建立了復方黃芪顆粒中黃芩苷的HPLC含量測定方法。結果表明，所建立的方法操作簡便、結果可靠、重復性好。