胥傳海，蘭建云，徐林成，李蕾，周林森

(鹽城市第一人民醫(yī)院 1.病理科；2.普外科，江蘇 鹽城 224500)

腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)是起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，約占腎癌的85%，腎細(xì)胞癌在我國(guó)發(fā)病率居泌尿系惡性腫瘤第2位[1]。最新研究顯示腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展與細(xì)胞的代謝紊亂息息相關(guān)，糖和脂肪的代謝異常在KIRC中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。

心室區(qū)表達(dá)PH域的蛋白質(zhì)同源物1(ventricular zone-expressed PH domain-containing protein homo-log 1，VEPH1)基因于2000年首次在人胚胎腦組織中發(fā)現(xiàn)，在人腎臟、胰腺、脾臟和胚胎腦組織中高表達(dá)[2,4-5]。既往研究發(fā)現(xiàn)，VEPH1定位于蛋白羧基端的結(jié)構(gòu)域是一種常見的蛋白組件，存在于200多種信號(hào)傳導(dǎo)蛋白及細(xì)胞骨架蛋白中。VEPH1參與蛋白質(zhì)—脂質(zhì)、蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)之間的相互作用，影響胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸和定位，參與信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞骨架的構(gòu)成[6]。本研究應(yīng)用癌癥基因組圖譜(The Can-cer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)和人類蛋白質(zhì)圖集(The Human Protein Atlas,HPA)數(shù)據(jù)庫(kù)探討VEPH1基因與KIRC患者預(yù)后的關(guān)系及其潛在的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 VEPH1基因表達(dá)差異及其與KIRC預(yù)后關(guān)系分析

GEPIA(http:∥gepia.Cancer-pku.cn/index.Html)是由北京大學(xué)開發(fā)的交互式web服務(wù)器。在TCGA的KIRC數(shù)據(jù)中檢索VEPH1，主要分析條件如下，“Expression DIY”模塊：Boxplot中選擇“VEPH1”、“KIRC”及“Match TCGA normal and GTEx data”。選擇“Survival”模塊：Survival Plots中選擇“VEPH1”、“Overall Survival”及“KIRC”，進(jìn)行Mantel-Cox檢驗(yàn)分析，并導(dǎo)出總生存曲線圖。基于該數(shù)據(jù)庫(kù)的測(cè)序數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析VEPH1基因在腫瘤組織與癌旁組織中的表達(dá)差異，VEPH1在正常腎組織和KIRC組織中的表達(dá)差異，VEPH1基因與KIRC預(yù)后的相關(guān)性。R3.6.2軟件設(shè)計(jì)配對(duì)t檢驗(yàn)函數(shù)，比較100例患者腫瘤和癌旁組織中VEPH1基因的表達(dá)量是否有顯著差異。

1.2 VEPH1基因與KIRC患者預(yù)后關(guān)系的分析

TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載整理530例KIRC的基因表達(dá)數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，使用R3.6.2版本軟件的“survival”包分析，單因素分析各臨床指標(biāo)與患者生存是否相關(guān)。

1.3 VEPH1蛋白在腫瘤和癌旁組織表達(dá)分析

從HPA數(shù)據(jù)庫(kù)下載3例正常腎臟組織和10例KIRC組織VEPH1免疫組化結(jié)果(抗體編號(hào):HPA026645)，分析VEPH1蛋白的表達(dá)。

1.4 Cbioportal數(shù)據(jù)庫(kù)分析VEPH1在KIRC組織中表達(dá)降低的原因

利用Cbioportal(https:∥www.cbioportal.org/)網(wǎng)站，搜索VEPH1基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)448例KIRC患者腫瘤組織中的錯(cuò)譯率與突變率(篩選條件：Kidney Renal Clear Cell Carcinoma,TCGA,Firehose Legacy)。

1.5 基因集富集分析(GSEA)分析VEPH1基因在KIRC中主要參與的通路

根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)集538例KIRC患者基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，運(yùn)用GSEA軟件分析VEPH1表達(dá)水平與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路基因集的相關(guān)。在GSEA中，使用h.all.v7.1.symbols.gmt c2.作為參照基因集，將P<0.05及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rates,FDR)<0.25的基因集作為顯著富集的基因集。

2 結(jié)果

2.1 VEPH1在KIRC腫瘤與癌旁組織中的表達(dá)差異

利用GEPIA平臺(tái)泛腫瘤分析發(fā)現(xiàn)，VEPH1mRNA在人體正常器官組織中廣泛表達(dá)，但是，在KIRC中，VEPH1在腫瘤組織與癌旁組織中表達(dá)差異最大(圖1A)。TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)523例KIRC腫瘤組織與100例癌旁組織VEPH1mRNA表達(dá)的分析結(jié)果顯示，KIRC腫瘤中VEPH1mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁組織(t=12.64，P<0.05)，見圖1B。配對(duì)比較100例KIRC患者腫瘤與癌旁組織中VEPH1mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示VEPH1mRNA在腫瘤組織中明顯降低(圖1C)。

2.2 VEPH1在KIRC腫瘤和癌旁組織中的蛋白表達(dá)

從HPA數(shù)據(jù)庫(kù)下載3例正常腎組織和10例KIRC腫瘤組織VEPH1免疫組化結(jié)果，VEPH1蛋白在正常腎組織中普遍呈高表達(dá)(圖2)，而10例KIRC腫瘤組織中2例呈高表達(dá)，6例呈中表達(dá)，2例呈低表達(dá)，且主要定位于核質(zhì)，呈棕褐色。KIRC腫瘤中VEPH1在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)相對(duì)一致，且均較正常腎組織呈現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。

A：GEPIA平臺(tái)泛腫瘤分析；B：KIRC腫瘤組織中VEPH1 mRNA表達(dá)量顯著低于癌旁組織；C：配對(duì)比較100例KIRC患者腫瘤組織與癌旁組織VEPH1 mRNA表達(dá)圖1 生物信息學(xué)分析VEPH1基因在KIRC與癌旁組織中的表達(dá)

圖2 VEPH1蛋白在正常腎組織(左圖)和KIRC組織(右圖)中的表達(dá)

2.3 VEPH1低表達(dá)與KIRC患者預(yù)后相關(guān)

GEPIA網(wǎng)站分析VEPH1mRNA表達(dá)與患者生存期長(zhǎng)短的相關(guān)性(圖3)，結(jié)果顯示KIRC腫瘤中的VEPH1表達(dá)越低，患者生存期越短(P<0.05)。單因素COX回歸分析提示KIRC患者預(yù)后與年齡、淋巴結(jié)受累、VEPH1mRNA表達(dá)均顯著相關(guān)(表1)。

表1 KIRC患者生存預(yù)后與臨床病理參數(shù)和VEPH1表達(dá)的關(guān)系

圖3 VEPH1 mRNA表達(dá)與KIRC患者生存期的關(guān)系

2.4 VEPH1 mRNA低表達(dá)原因分析

登錄Cbioportal網(wǎng)站，搜索VEPH1基因在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)448例KIRC患者腫瘤組織中的錯(cuò)譯率與突變率，僅出現(xiàn)2例錯(cuò)譯與突變，擴(kuò)增的概率僅為1.1%(圖4)。VEPH1mRNA在KIRC腫瘤中表達(dá)降低的原因，推測(cè)主要是與腫瘤環(huán)境改變有關(guān)，而不是與基因的錯(cuò)譯或者突變有關(guān)。

A：448例患者僅有2例發(fā)生錯(cuò)譯與突變；B：僅有1.1%的患者發(fā)生基因擴(kuò)增圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)448例KIRC患者基因突變測(cè)序分析

2.5 VEPH1功能富集分析

分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)選擇c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt[Curated]數(shù)據(jù)庫(kù)，高表達(dá)VEPH1的KIRC樣本中，在多種代謝相關(guān)的通路上顯著富集，包括丙酮酸代謝，色氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等多種重要的氨基酸代謝，以及淀粉、蔗糖和三酰甘油代謝(圖5)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化P值判斷，與代謝通路相關(guān)顯著的所有基因集名稱具體見表2。

圖5 GSEA數(shù)據(jù)庫(kù)分析VEPH1高表達(dá)相關(guān)基因集的富集

表2 GSEA分析VEPH1高表達(dá)富集的相關(guān)通路統(tǒng)計(jì)

3 討論

本研究分析VEPH1在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的測(cè)序信息以及患者臨床信息，首次發(fā)現(xiàn)VEPH1在KIRC組織中mRNA和蛋白水平均較正常腎組織表達(dá)量顯著降低；腫瘤組織中VEPH1mRNA高表達(dá)KIRC患者生存期顯著高于低表達(dá)的患者。大樣本統(tǒng)計(jì)腫瘤中VEPH1測(cè)序結(jié)果，VEPH1mRNA在腫瘤組織中只有極少數(shù)是錯(cuò)譯和突變，另外僅存在1.1%的基因擴(kuò)增。GSEA功能富集分析表明，VEPH1在KIRC腫瘤中高表達(dá)相關(guān)基因集主要富集在多種代謝通路中。因此，推測(cè)VEPH1在腫瘤中低表達(dá)，可能是與多種重要的氨基酸、糖類以及三酰甘油代謝通路活動(dòng)降低相關(guān)，這些代謝活動(dòng)減弱導(dǎo)致患者預(yù)后差，生存期顯著低于高表達(dá)患者。因此，VEPH1具有作為KIRC病理診斷標(biāo)志物的潛在價(jià)值。

GSEA分析結(jié)果顯示，VEPH1在KIRC組織中的表達(dá)量與丙酮酸代謝及色氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸等多種重要的氨基酸代謝有關(guān)，提示VEPH1與色氨酸及丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代謝通路有關(guān)，以及淀粉、蔗糖和三酰甘油代謝相關(guān)[7-8]。有研究顯示，腫瘤細(xì)胞在有氧條件下，同時(shí)存在無(wú)氧酵解，共同提供自身需要的代謝及增殖需要的能量[9]。GSEA分析顯示VEPH1高表達(dá)富集在三酰甘油通路，患者VEPH1高表達(dá)時(shí)，可能是由于三酰甘油代謝較低表達(dá)患者好，因此預(yù)后比低表達(dá)患者好[10]。VEPH1在KIRC組織中的表達(dá)量與丙酮酸相關(guān)，而丙酮酸濃度的改變可作為糖的有氧氧化和無(wú)氧酵解的分界點(diǎn)，丙酮酸代謝下降時(shí)，胞內(nèi)丙酮酸的濃度升高，為KIRC腫瘤細(xì)胞的無(wú)氧酵解提供了豐富的前體物質(zhì)[11-12]。腎癌患者血清中谷氨酸濃度較健康者升高，谷氨酰胺的濃度降低，可能是由于腎癌患者VEPH1表達(dá)普遍降低，與VEPH1相關(guān)的谷氨酸代謝降低相關(guān)[13]。VEPH1高表達(dá)腎癌患者的預(yù)后要好于低表達(dá)患者，推測(cè)是由于谷氨酸和谷氨酰胺濃度的增加促進(jìn)了谷胱甘肽的生成，提高了癌細(xì)胞的抗氧化能力，因此可能影響患者的預(yù)后[14]。越來(lái)越多的研究表明，代謝通路的異常與腎癌尤其是KIRC患者預(yù)后的關(guān)系極為密切[15]。

綜上所述，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法揭示了VEPH1可能參與KIRC的發(fā)生、發(fā)展，并具有作為KIRC診斷標(biāo)志物、預(yù)后指標(biāo)及治療靶點(diǎn)的潛在應(yīng)用價(jià)值。但VEPH1在KIRC中的作用及其機(jī)制還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)及豐富。