高星宇，王景芝，凌銳，周月鵬，毛朝明，陳德玉

(江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1.腫瘤治療中心；2.腫瘤學(xué)實驗室；3.核醫(yī)學(xué)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

乙酸鹽或乙酸對維持哺乳動物體內(nèi)能量平衡起著重要作用[1]。最新研究表明，在應(yīng)激條件下如低糖、營養(yǎng)受限等，游離乙酸鹽可以作為腫瘤細胞脂肪生成、能量代謝的重要碳源，其中乙酰輔酶A合成酶2(acetyl-CoA synthetase 2，ACSS2)發(fā)揮著關(guān)鍵樞紐作用[2]。目前已在膀胱癌[3]、腎癌[4]、乳腺癌[5]、肝癌[6]等腫瘤發(fā)現(xiàn)，ACSS2參與腫瘤浸潤、侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性進程，其異常表達常提示著不良預(yù)后。本研究以食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織樣本及細胞株作為研究對象，結(jié)合順鉑處理并通過靶向調(diào)控ACSS2蛋白表達，探究ACSS2在順鉑敏感性調(diào)控過程中的關(guān)鍵作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 組織標本、細胞株 選取2017年4月至2019年2月間于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院外科住院的40例食管鱗癌患者，于手術(shù)中收集每位患者的食管鱗癌瘤體及癌旁組織(距瘤體邊緣2～3 cm左右)標本，均為初診同時術(shù)前未接受任何腫瘤治療，所有樣本經(jīng)病理科確診并得到江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

食管鱗癌細胞株TE-1、ECA-109 及KYSE-150(上海吉凱基因技術(shù)公司)，正常食管鱗狀上皮細胞Het-1A(廣州吉尼歐生物科技有限公司)。

1.1.2 主要試劑 ACSS2抗體(美國Santa Cruz 公司)；p-PI3K、AKT/p-AKT、p-mTOR、p-Erk、cleaved-Caspase-3以及β-肌動蛋白單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)；順鉑(Cisplatin，DPP)購自美國Selleck公司；PI3K通路抑制劑LY290042(美國Med Chem Express公司)；HRP標記的抗鼠或抗兔二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)；CCK8以及Annexin-V/PI凋亡試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)；siRNA-ACSS2和siRNA陰性對照，陰性對照病毒CON238及過表達ACSS2慢病毒LV-ACSS2(上海吉凱基因技術(shù)公司)。

1.2 免疫組化檢測食管鱗癌及癌旁組織中ACSS2的表達

組織樣本經(jīng)4%多聚甲醛固定后以石蠟進行包埋，連續(xù)切片(厚度4 μm)，切片經(jīng)脫蠟水化以3%過氧化氫孵育，PBS沖洗并抗原修復(fù)后置于含ACSS2抗體稀釋液(1 ∶200)中，于4 ℃冰箱中浸染過夜，次日沖洗3次后加入對應(yīng)二抗工作液結(jié)合，再次清洗后DAB顯色封片觀察。腫瘤組織及癌旁組織樣本均以200倍鏡下隨機選取5個視野進行免疫組化評分，其中ACSS2表達強度分為：陰性為0分，弱陽性為1分，陽性為2分，強陽性為3分；表達程度評分標準如下：<25%者為0分，<50%但≥25%者為1分，≥50%同時<75%者為2分，≥75%者為3分。上述兩項得分相乘計為總得分：0分記為“-”，1～5分記為“+”，6～9分記為“++”。

1.3 細胞培養(yǎng)以及脂質(zhì)體、慢病毒轉(zhuǎn)染

食管鱗癌細胞株TE-1、ECA-109 及KYSE-150培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合的RPMI-1640培養(yǎng)基，正常食管鱗狀上皮細胞Het-1A培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素混合的DMEM培養(yǎng)基，均在37℃ 、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，以(3～4)×104個/mL密度接種于6孔板中，并將其隨機分為3組：siRNA-ACSS2組(siRNA-ACSS2轉(zhuǎn)染)，siRNA-NC組(siRNA陰性對照)及對照組(未做任何處理)。依照Lipofectamine 2000試劑說明轉(zhuǎn)染上述不同組細胞，無血清培養(yǎng)基內(nèi)轉(zhuǎn)染6 h后更換為含血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，再行收集細胞進行后續(xù)的實驗。序列如下，siRNA-ACSS2-1：正義鏈5′-CAUCUGUCAUCAGUCACCUTT-3′；反義鏈5′-AGGUGACUGA-UGACAGAUGTT-3′；siRNA-ACSS2-2：正義鏈5′-CAGGAUGGCUAUUACUGGATT-3′；反義鏈5′-UCCAGUAAUAGCCAUCCUGTT-3′；siRNA-ACSS2-3：正義鏈5′-CGGGAUCGUUUGCAAGUAATT-3′；反義鏈5′-UUACUUGCAAACGAUCCCGTT-3′；siRNA-NC：正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反義鏈5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。陰性對照病毒CON238及LV-ACSS2感染72 h后利用含嘌呤霉素培養(yǎng)基(4 μg/mL)篩選出轉(zhuǎn)染細胞并運用免疫印跡實驗驗證過表達效果。

1.4 蛋白質(zhì)印跡檢測食管鱗癌組織及細胞中ACSS2蛋白的表達

食管鱗癌及癌旁組織蛋白提取需先去除壞死等組織，以每50 mg組織取500 μL的比例加入含蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液，玻璃研磨棒冰上研磨10 min；細胞蛋白(食管鱗癌細胞株TE-1、ECA-109 及KYSE-150，正常食管鱗狀上皮細胞Het-1A)以6孔板為例：細胞經(jīng)PBS清洗3次后加入100 μL裂解液冰上處理10 min，收集后4℃條件下12 000×g離心10 min，經(jīng)BCA法測定蛋白含量后加入上樣緩沖液，100 ℃下熱變性10 min。根據(jù)目的蛋白分子大小于10%～12%的SDS-PAGE凝膠電泳后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST于37 ℃水浴搖床上封閉60 min，加入稀釋好的一抗ACSS2(1 ∶2 000配置)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日TBST 洗3次，每次10 min；抗鼠二抗室溫孵育60 min后，TBST 再次清洗3次，每次10 min，最后加入曝光液顯影、拍攝、計算灰度值。

1.5 CCK8實驗檢測ACSS2干擾對TE-1細胞順鉑IC50值的影響

將TE-1細胞設(shè)置為4組：未處理(空白對照)組，siRNA-NC組(陰性對照組)，siRNA-ACSS2-1組和siRNA-ACSS2-3組。于96孔板中種植5×103個細胞/孔，待細胞貼壁后分別進行siRNA處理24 h，每組處理設(shè)6個平行孔。順鉑按濃度梯度(3.125、6.25、12.5、25、50 μg/mL)加入處理 24 h，并于實驗終止前每孔加10 μL的CCK8，振蕩、孵育2 h后在酶聯(lián)檢測儀上檢測 450 nm 波長下每孔光密度(D)值，按公式(實驗組D值/空白孔D值)×100%求出細胞活力值，根據(jù)細胞活力值擬合函數(shù)曲線計算IC50值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測下調(diào)ACSS2對TE-1細胞凋亡的影響

TE-1細胞種于6孔板，設(shè)置為6組：陰性對照組，順鉑(5 μg/mL)組，siRNA-ACSS2-1組，siRNA-ACSS2-3組，siRNA-ACSS2-1+順鉑組，siRNA-ACSS2-3+順鉑組。待細胞貼壁后行siRNA-ACSS2、siRNA-NC處理48 h，順鉑(5 μg/mL)單獨處理24 h或者siRNA-ACSS2處理24 h后聯(lián)合順鉑(5 μg/mL)處理24 h。隨后，細胞經(jīng)消化離心后用4℃預(yù)冷的PBS洗3次，每孔細胞收集于流式管內(nèi)用500 μL緩沖液重懸，每管避光加入5 μL的Annexin V-FITC，上機前15 min加入5 μL碘化丙啶后檢測凋亡水平。

1.7 蛋白質(zhì)印跡檢測PI3K/AKT信號通路及cleaved-Caspase-3蛋白的表達

TE-1細胞種于6孔板，設(shè)置為6組：陰性對照組，siRNA-ACSS2-3組，LV-ACSS2組，順鉑組，siRNA-ACSS2-3+順鉑組與LV-ACSS2+順鉑組。細胞蛋白提取、濃度測定等步驟同“1.4”。加入稀釋好的一抗p-mTOR、p-Erk1/2、p-PI3K、AKT/p-AKT、cleaved-Caspase-3(均按1 ∶1 000配置)，孵育、清洗后抗鼠或抗兔二抗再次孵育后，經(jīng)曝光、拍攝并根據(jù)灰度值計算各蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 ACSS2在食管鱗癌及癌旁組織中的表達

免疫組化可見，食管鱗癌細胞胞質(zhì)中ACSS2多呈陽性或強陽性；癌旁組織中除基底、固有腺區(qū)域內(nèi)細胞中有較高的ACSS2表達外，整體表達強度均較低(圖1)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，食管鱗癌組織中ACSS2表達總得分++、+的比例分別為47.5%(19/40)和50%(20/40)，癌旁組織中++、+的比例分別是22.5%(9/40)和37.5%(15/40)，兩組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.79，P<0.001，表1)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果證實，食管鱗癌瘤體中ACSS2蛋白表達水平顯著高于癌旁組織(Z=6.668，P<0.001，圖2)。

圖1 食管鱗癌及癌旁組織中ACSS2的表達(免疫組化，×200)

表1 食管鱗癌及癌旁組織中ACSS2表達總得分結(jié)果

N1-N3:癌旁組織；T1-T3:食管鱗癌組織圖2 蛋白質(zhì)印跡檢測食管鱗癌組織中ACSS2表達

2.2 食管鱗癌細胞中ACSS2蛋白表達水平

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，與Het-1A細胞相比，食管鱗癌細胞TE-1、ECA-109及KYSE-150均有較強的ACSS2表達(圖3)。siRNA-ACSS2-3干擾效果最明顯，siRNA-ACSS2-1和-2的效果較為一致且均弱于siRNA-ACSS2-3(圖4)。

*：P<0.01；#：P<0.001，與Het-1A比較圖3 蛋白質(zhì)印跡檢測正常食管鱗狀上皮細胞與食管鱗癌細胞中ACSS2表達差異

*：P<0.01；#：P<0.001，與空白對照組及陰性對照組比較圖4 蛋白質(zhì)印跡驗證TE-1細胞靶向干擾ACSS2效果

2.3 食管鱗癌細胞中ACSS2表達對順鉑的IC50值的影響

CCK8實驗結(jié)果顯示，相同濃度(除12.5 μg/mL濃度外)的順鉑條件下，siRNA-ACSS2-1、3處理組的TE-1細胞活力較空白對照組、陰性對照組均顯著下降(P<0.05)；空白對照組TE-1細胞順鉑的 IC50值為23.24 μg/mL，陰性對照組為24.82 μg/mL，siRNA-ACSS2-1和-3處理后下降到15.88 μg/mL和14.57 μg/mL (F=6.496，P<0.01，圖5)。

圖5 CCK8檢測ACSS2干擾對TE-1細胞順鉑IC50值的影響

2.4 食管鱗癌細胞中ACSS2表達改變對順鉑殺傷能力的影響

流式細胞術(shù)結(jié)果表明，siRNA-ACSS2處理48 h后，陰性對照組、siRNA-ACSS2-1組和siRNA-ACSS2-3組TE-1細胞凋亡率分別為(2.05±0.04)%，(4.34±0.12)%和(3.24±0.12)%，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=367.897，P<0.001)。5 μg/mL順鉑處理24 h后TE-1細胞凋亡率為(9.68±0.57)%，而經(jīng)siRNA-ACSS2-1、siRNA-ACSS2-3預(yù)處理24 h，再順鉑處理24 h后TE-1細胞凋亡率分別上調(diào)至(13.81±0.60)%和(15.82±0.13)%，3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=62.778，P<0.001)。結(jié)果表明，下調(diào)ACSS2表達可以增強TE-1細胞對順鉑的敏感性(圖6)。

*：P<0.01，#：P<0.001圖6 流式細胞術(shù)檢測ACSS2干擾對TE-1細胞順鉑敏感性的影響

2.5 ACSS2對PI3K/AKT信號通路和凋亡相關(guān)蛋白的影響

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，過表達ACSS2后PI3K/AKT信號通路出現(xiàn)持續(xù)活化，而PI3K通路靶向抑制劑LY290042處理(10 μmol/L)24 h可以有效逆轉(zhuǎn)這一進程發(fā)生(圖7)。順鉑處理可以誘導(dǎo)TE-1細胞中ACSS2的表達上調(diào)以及PI3K/AKT信號通路活化；在靶向下調(diào)ACSS2后可見TE-1細胞中p-PI3K、p-AKT表達顯著降低而凋亡相關(guān)cleaved-Caspase-3 蛋白表達量明顯升高，過表達ACSS2維持PI3K/AKT信號活化，同時可逆轉(zhuǎn)cleaved-Caspase-3的表達(圖8)。

圖7 蛋白質(zhì)印跡檢測ACSS2過表達后PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白

圖8 蛋白質(zhì)印跡檢測PI3K/AKT通路及cleaved-Caspase-3的表達

3 討論

食管鱗癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者初次確診即為中晚期，造成臨床工作中較易見早期局部或者遠端轉(zhuǎn)移、擴散，患者喪失了手術(shù)切除的機會，需要放療、化療等綜合手段干預(yù)[7-9]。對于不具備手術(shù)切除條件的食管鱗癌患者，目前標準治療方案為同步放化療，其中聯(lián)合化療最常用方案為5-氟尿嘧啶和順鉑[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后化療采用順鉑可以有效地控制發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)腫瘤進展，但是當前同步放化療處理后5年生存率僅在27%左右，超過40%的患者未見明顯改善或出現(xiàn)復(fù)發(fā)[11-13]。本研究探討食管鱗癌細胞順鉑敏感性的關(guān)鍵信號通路和調(diào)控機制，以期為提高化療效果和改善患者預(yù)后提供理論依據(jù)。

現(xiàn)代研究認為，腫瘤的快速生長不可避免地會導(dǎo)致代謝壓力，而代謝重編程作為腫瘤惡性特征之一賦予了腫瘤細胞克服代謝壓力并維持生長和增殖的能力，其中最常見的代謝表型就是瓦博格(Warburg)效應(yīng)，即腫瘤細胞在氧氣充足的情況下仍以糖酵解為主。研究證實，腫瘤細胞在不斷攝取葡萄糖的同時對其他代謝物質(zhì)如乙酸鹽的依賴也會增加，而ACSS2可以利用乙酸鹽大量合成乙酰輔酶A提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，因此ACSS2的異常表達勢必影響著腫瘤發(fā)生、發(fā)展[2]。例如，在腎癌組織中不僅可觀察到ACSS2的累積，而且高表達ACSS2的患者表現(xiàn)為較高的腫瘤分期、易轉(zhuǎn)移性以及更低的生存率[4]；當乳腺癌細胞處于缺氧、脂質(zhì)缺乏條件下，ACSS2的表達上調(diào)是維持腫瘤細胞增殖的關(guān)鍵分子基礎(chǔ)[5]。然而需要注意的是，在不同類型腫瘤中ACSS2表達水平與惡性進程間的關(guān)系尚存較大爭議：肝癌細胞株及瘤體內(nèi)ACSS2的表達強度均較低；下調(diào)ACSS2表達可以阻斷HIF-2α乙?；瘡亩龠M轉(zhuǎn)移發(fā)生[6]。因此本研究首先通過免疫組化檢測了食管鱗癌組織及癌旁組織中的ACSS2表達，發(fā)現(xiàn)多數(shù)腫瘤細胞胞質(zhì)中可見ACSS2強表達；而在癌旁組織中處于固有腺和基底膜附近增殖較旺盛區(qū)域的正常細胞亦可見陽性甚至強陽性ACSS2；統(tǒng)計免疫組化結(jié)果以及進一步通過組織勻漿蛋白質(zhì)印跡檢測顯示，食管鱗癌組織中ACSS2蛋白總體表達水平要明顯高于癌旁組織。已有文獻報道，對膀胱癌細胞進行ACSS2的靶向抑制劑處理可以顯著提高順鉑的殺傷作用[3]。本研究結(jié)果表明，靶向下調(diào)ACSS2能明顯降低食管鱗癌細胞的順鉑IC50值；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，siRNA-ACSS2單獨處理即可引發(fā)腫瘤細胞凋亡，并可以顯著增強順鉑對食管鱗癌的殺傷作用。上述結(jié)果表明，食管鱗癌細胞中高表達的ACSS2可能參與順鉑敏感性的調(diào)控。

眾多研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路在多種類型惡性腫瘤的增殖、抗凋亡、轉(zhuǎn)移發(fā)生等一系列進程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用[14-15]。在腎癌細胞相關(guān)研究中證實，ACSS2可通過PI3K/AKT信號通路調(diào)控浸潤、侵襲發(fā)生[4]；而最新的研究表明，食管鱗癌中PI3K/AKT信號通路的過度激活會通過作用于凋亡相關(guān)蛋白如Caspase家族蛋白等表達參與順鉑敏感性調(diào)控[16-18]。本研究中，上調(diào)或下調(diào)食管鱗癌細胞中ACSS2的表達可直接促進或者抑制p-PI3K、p-AKT的活化水平；結(jié)合PI3K/AKT信號通路靶向抑制劑證實，ACSS2通過影響PI3K/AKT下游靶蛋白cleaved-Caspase-3 形成調(diào)控食管鱗癌細胞對順鉑的敏感性。

綜上所述，食管鱗癌細胞中異常高表達的ACSS2可能通過PI3K/AKT信號通路活化以及凋亡蛋白cleaved-Caspase-3形成參與順鉑敏感性調(diào)控，表明ACSS2或可作為提高食管鱗癌化療療效和改善患者預(yù)后的潛在干預(yù)靶點。