劉婷婷，董麗華，張宇，徐偉，朱海濤，李芳，王蘇華，邢光偉，陸榮柱

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.常州市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇 常州 213000；3.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

汞是一種天然存在的金屬元素，可分為無機(jī)汞和有機(jī)汞[1]。水生微生物通過促進(jìn)無機(jī)汞的甲基化使其成為毒性更大的甲基汞而更易在食物鏈中產(chǎn)生生物富集[2]。人類主要通過食用含甲基汞的魚類而暴露于甲基汞中[3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)是甲基汞毒性的主要靶器官[4]，近來甲基汞致肝臟和腎臟等非神經(jīng)系統(tǒng)的損傷也逐漸引起關(guān)注[5-6]。鐵死亡是一種新命名的以鐵依賴性脂質(zhì)過氧化為特征的程序性死亡方式[7]；其廣泛參與神經(jīng)[8]及肝臟系統(tǒng)的缺血缺氧損傷[9]，且多與谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)表達(dá)下降有關(guān)[10]。但甲基汞與鐵死亡之間的關(guān)系尚不明確。Fe2+作為脯氨酸羥化酶活性的重要輔因子，在缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)的降解中起重要作用。HIF-1α是一種普遍存在于哺乳動物體內(nèi)，為適應(yīng)低氧環(huán)境而表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。前期研究表明甲基汞的毒性與脯氨酸羥化酶活性增強(qiáng)進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α降解有關(guān)[11]，由此推測甲基汞增強(qiáng)脯氨酸羥化酶的活性可能與Fe2+負(fù)載有關(guān)。去鐵胺可以抑制甲基汞的氧化毒性[12]，其作為鐵離子螯合劑可抑制鐵死亡[13-14]，同時去鐵胺可抑制脯氨酸羥化酶的活性從而抑制HIF-1α降解[15]，但去鐵胺拮抗甲基汞的毒性效應(yīng)是否是通過抑制鐵死亡而實現(xiàn)的尚不明確。因此，本研究一方面探討甲基汞的毒性與鐵死亡之間的關(guān)系，另一方面選用去鐵胺作為鐵死亡抑制劑，探討其在甲基汞致細(xì)胞損傷中的作用和相關(guān)分子信號機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞系和正常大鼠肝BRL細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所；甲基汞、二甲基亞砜、MTT(美國Sigma公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；兔抗HIF-1α單克隆抗體(美國ImmunoWay公司)；兔抗GPx4單克隆抗體、去鐵胺試劑(英國Abcam公司)；羊抗兔二抗、β-肌動蛋白(美國Santa Cruz公司)；蛋白濃度相關(guān)試劑盒、抗體稀釋液、上下分離膠配置試劑盒(碧云天試劑公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞置于-80 ℃冰箱保存，進(jìn)行細(xì)胞實驗時，取出置于37 ℃水浴鍋中快速搖動復(fù)蘇，完全融化后轉(zhuǎn)移至含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，并置于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；隔2 d用胰酶進(jìn)行消化傳代并繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞均勻鋪滿孔底75%～85%時進(jìn)行后續(xù)實驗。傳代次數(shù)不超過10代。

1.3 細(xì)胞分組和處理

取PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞以5 000個/孔密度接種于96孔板，以50 000個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞均勻鋪滿孔底75%～85%時進(jìn)行后續(xù)實驗。

細(xì)胞分組：對照組用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞0.5 h；實驗組用含不同濃度甲基汞(1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L)培養(yǎng)基處理細(xì)胞0.5 h。用MTT法檢測細(xì)胞活力，蛋白印跡法檢測GPx4蛋白表達(dá)。篩選最適濃度甲基汞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測細(xì)胞活力

取“1.3”處理后細(xì)胞；棄培養(yǎng)基，每孔加入100 μL含0.05 g/mL MTT溶液的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄培養(yǎng)基，加入150 μL二甲基亞砜溶液，避光并充分振蕩混勻；利用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處光密度(D)值，并計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力=(實驗組D值-空白組D值)/(對照孔D值-空白組D值)。

1.5 蛋白印跡實驗檢測HIF-1α及GPx4蛋白表達(dá)

收集“1.3”處理后細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌3次，用含1% PMSF的RIPA裂解緩沖液冰上裂解10～15 min；收集至EP管，4 ℃以12 000×g離心15 min，收集上清液；用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度；加入5×上樣緩沖液，煮沸5 min；80 V經(jīng)SDS-PAGE分離蛋白；300 mA 90 min轉(zhuǎn)至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉2 h；TBST緩沖液洗膜3次；加入對應(yīng)的一抗稀釋液(HIF-1α和GPx4為1 ∶1 000，β-肌動蛋白為1 ∶10 000，稀釋液為5%脫脂牛奶)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(TBST稀釋，1 ∶10 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3次；將PVDF膜置于凝膠成像系統(tǒng)，加入一定的曝光劑進(jìn)行曝光、成像分析，Lane 1D軟件用于灰度分析。

1.6 去鐵胺預(yù)處理對細(xì)胞活力及GPx4和HIF-1α蛋白表達(dá)的影響

取PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞以5 000個/孔密度接種于96孔板中，以50 000個/孔接種于6孔板，待細(xì)胞均勻鋪滿孔底75%～85%時進(jìn)行后續(xù)實驗。

細(xì)胞分組：對照組用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞 6.5 h；去鐵胺+甲基汞組分別用0、50、100、200、400 μmol/L去鐵胺預(yù)處理6 h，棄培養(yǎng)液，加10.0 μmol/L甲基汞繼續(xù)培養(yǎng)0.5 h。用MTT法分析細(xì)胞活力，蛋白印跡法檢測GPx4和HIF-1α蛋白表達(dá)，具體方法同“1.4”和“1.5”。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 甲基汞降低PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞活力

MTT結(jié)果顯示，與對照組相比，在PC12細(xì)胞中，5.0 μmol/L和10.0 μmol/L甲基汞處理后，細(xì)胞活力明顯降低(q=5.754、9.761，P均<0.05)；與5.0 μmol/L甲基汞組相比，10.0 μmol/L甲基汞組細(xì)胞活力下降更顯著(q=4.077，P<0.05)，呈一定的劑量依賴性。在BRL細(xì)胞中，10.0 μmol/L甲基汞組細(xì)胞活力較對照組明顯降低(q=10.67，P<0.05)。因此，選擇10.0 μmol/L甲基汞進(jìn)行后續(xù)實驗。見圖1。

a:P<0.05，與對照組比較;b:P<0.05,與5.0 μmol/L比較圖1 MTT法檢測不同濃度甲基汞處理后兩種細(xì)胞活力的變化

2.2 甲基汞降低PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞中GPx4蛋白表達(dá)

免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，在PC12細(xì)胞中，2.5、5.0、和10.0 μmol/L甲基汞處理后，GPx4蛋白表達(dá)明顯降低(q=4.220、5.601、6.817，P均<0.05)；在BRL細(xì)胞中，5.0和10.0 μmol/L甲基汞組GPx4蛋白表達(dá)明顯降低(q=3.618、3.955，P均<0.05)。見圖2。

a:P<0.05，與對照組比較圖2 免疫印跡法檢測不同濃度甲基汞處理后兩株細(xì)胞中GPx4蛋白表達(dá)

2.3 去鐵胺預(yù)處理逆轉(zhuǎn)甲基汞致PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞中GPx4蛋白表達(dá)降低

免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞中GPx4蛋白表達(dá)明顯降低(q=3.3、2.958，P均<0.05)；與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，50、100、200和400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細(xì)胞GPx4蛋白表達(dá)明顯增加(q=3.614、7.879、7.296、11.50，P均<0.05)；且各濃度間GPx4蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，除外100 μmol/L去鐵胺+甲基汞組與200 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中GPx4蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在BRL細(xì)胞中，400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中GPx4蛋白表達(dá)較0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組明顯增加(q=3.390，P<0.05)。見圖3。

2.4 去鐵胺預(yù)處理逆轉(zhuǎn)甲基汞致PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)降低

免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組相比，0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯降低(q=2.932、3.044，P均<0.05)。與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，50、100、200和400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)均明顯增加(P均<0.05)；與50 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯增加(q=3.900，P<0.05)。100、200和400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組BRL細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)明顯高于0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組(q=2.819、2.908、3.389，P均<0.05)。見圖4。

a:P<0.05，與對照組比較；b:P<0.05，與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；c：P<0.05，與50 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；d：P<0.05，與100 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；e：P<0.05，與200 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較圖3 免疫印跡法檢測不同濃度去鐵胺預(yù)處理后細(xì)胞中GPx4蛋白表達(dá)

a:P<0.05，與對照組比較，b:P<0.05，與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；c:P<0.05，與50 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較；圖4 免疫印跡法檢測不同濃度去鐵胺預(yù)處理后細(xì)胞中HIF-1α蛋白表達(dá)

2.5 去鐵胺預(yù)處理逆轉(zhuǎn)甲基汞致PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞活力降低

與對照組相比，0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組中PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞活力明顯降低(q=8.675、5.30，P均<0.05)。與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組相比，400 μmol/L去鐵胺+甲基汞組PC12細(xì)胞活力明顯增加(q=3.607，P<0.05)，200 μmol/L去鐵胺+甲基汞組BRL細(xì)胞活力明顯增加(q=2.781，P<0.05)。見圖5。

a:P<0.05，與對照組比較，b:P<0.05，與0 μmol/L去鐵胺+甲基汞組比較圖5 MTT法檢測不同濃度去鐵胺預(yù)處理后細(xì)胞活性變化

3 討論

本研究采用神經(jīng)元樣PC12作為神經(jīng)元模型，利用大鼠肝BRL細(xì)胞作為非神經(jīng)元模型。實驗結(jié)果表明，甲基汞濃度為5.0和10.0 μmol/L時，PC12細(xì)胞活力明顯降低，甲基汞濃度為10.0 μmol/L時，BRL細(xì)胞活力明顯降低，表明神經(jīng)元細(xì)胞模型可能對甲基汞毒性更加敏感，這與Miura等[16]發(fā)現(xiàn)相一致，其機(jī)制可能與汞更容易蓄積于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[17]，也可能與肝臟系統(tǒng)較強(qiáng)大的排泄作用及促進(jìn)甲基汞的去甲基化作用有關(guān)[18]。已有研究發(fā)現(xiàn)多種藥物和化學(xué)毒物毒性機(jī)制涉及鐵死亡，例如，鐵死亡在鋁致神經(jīng)元死亡中起到重要作用，其機(jī)制主要涉及谷胱甘肽表達(dá)下調(diào)及活性氧生成[14]。甲基汞毒性主要與谷胱甘肽的耗竭、活性氧的生成等進(jìn)而造成機(jī)體氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，且該損傷可能由Fe2+所介導(dǎo)[12]。GPx4作為調(diào)控氧化應(yīng)激損傷的重要調(diào)控因子，亦是鐵死亡的關(guān)鍵調(diào)控基因，并且對神經(jīng)組織平衡的維持具有重要作用[19]。中樞神經(jīng)是甲基汞最重要的靶器官，但甲基汞的細(xì)胞毒性是否與調(diào)控GPx4表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡相關(guān)仍不明確。在本實驗中，甲基汞濃度為2.5 μmol/L時，PC12細(xì)胞中GPx4蛋白表達(dá)明顯降低；在BRL細(xì)胞中，甲基汞濃度為5 μmol/L 時，GPx4蛋白表達(dá)降低。PC12細(xì)胞中GPx4蛋白對甲基汞濃度更加敏感，可能與肝臟具有較強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激損傷有關(guān)，也提示PC12細(xì)胞對甲基汞毒性更加敏感的機(jī)制可能與甲基汞作用后GPx4蛋白下降更明顯有關(guān)，同時提示甲基汞的毒性可能與其誘導(dǎo)鐵死亡相關(guān)。

去鐵胺作為一種傳統(tǒng)的鐵螯合劑，在麥芽酚鋁致PC12細(xì)胞鐵死亡中起重要拮抗作用，其機(jī)制可能與去鐵胺降低細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量和增加細(xì)胞抗氧化損傷能力而抑制鐵死亡有關(guān)[14]。本實驗中選用不同濃度去鐵胺進(jìn)行預(yù)處理后，在PC12細(xì)胞和BRL細(xì)胞中，去鐵胺濃度分別為400、200 μmol/L時可以拮抗甲基汞的毒性，一方面表明去鐵胺為一種有效的化學(xué)毒物致?lián)p傷的拮抗劑，另一方面表明在神經(jīng)元細(xì)胞中拮抗甲基汞毒性需要較高濃度的去鐵胺，說明甲基汞致神經(jīng)細(xì)胞損傷后可能較難逆轉(zhuǎn)。GPx4蛋白表達(dá)下降是鐵死亡發(fā)生的關(guān)鍵事件之一，在急性腎衰模型中，利用鐵螯合劑上調(diào)GPx4蛋白可以抑制鐵死亡誘導(dǎo)劑所致的細(xì)胞死亡[19]。去鐵胺作為一種鐵死亡拮抗劑，能夠減輕氧化應(yīng)激損傷，增加多巴胺活性，從而改善運(yùn)動神經(jīng)癥狀。本研究發(fā)現(xiàn)，去鐵胺預(yù)處理后，除200 μmol/L與100 μmol/L比較GPx4蛋白表達(dá)增加無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他濃度組間GPx4蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，表明在50～100 μmol/L以及200～400 μmol/L范圍內(nèi)呈一定的濃度依賴性；在BRL細(xì)胞中，僅400 μmol/L去鐵胺處理時GPx4表達(dá)增加，未呈一定的濃度依賴性，一方面提示去鐵胺拮抗甲基汞毒性可能與增加GPx4蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制鐵死亡有關(guān)，另一方面提示GPx4蛋白表達(dá)增加在去鐵胺拮抗甲基汞致神經(jīng)細(xì)胞損傷中更為敏感，且在一定濃度范圍內(nèi)呈一定的劑量依賴性。

在氧化應(yīng)激的體外模型中，鐵螯合劑的保護(hù)作用與激活HIF-1相關(guān)，且調(diào)控HIF-1α降解的關(guān)鍵酶——脯氨酸羥化酶的抑制劑在拮抗鐵死亡方面亦起重要作用[20]，去鐵胺作為鐵離子螯合劑，一方面可以抑制鐵死亡，另一方面可以抑制HIF-1α降解。本實驗發(fā)現(xiàn)50、100、200和400 μmol/L去鐵胺作用后，PC12細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)增加，且400 μmol/L去鐵胺預(yù)處理后HIF-1α表達(dá)較50 μmol/L顯著增加；在BRL細(xì)胞中，100、200和400 μmol/L預(yù)處理后HIF-1α表達(dá)增加。一方面表明HIF-1α上調(diào)在去鐵胺拮抗甲基汞致鐵死亡中可能亦存在著重要作用；另一方面，甲基汞毒性與其損傷線粒體造成機(jī)體氧氣利用障礙有關(guān)，PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元，對氧濃度更為敏感[21]，因此去鐵胺濃度較低時，PC12細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)上調(diào)，以更好地拮抗甲基汞致神經(jīng)元因氧氣利用障礙造成的損傷。

目前關(guān)于甲基汞的毒性與鐵死亡間關(guān)系的研究仍不完善，需要增加一些新的指標(biāo)，如谷胱甘肽含量測定，細(xì)胞內(nèi)鐵離子測定等。同時，雖然本研究表明去鐵胺可以通過上調(diào)HIF-1α及GPx4起到拮抗甲基汞的毒性作用，但HIF-1α與GPx4的關(guān)系亦未完全確定，尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，甲基汞毒性可能與其誘導(dǎo)鐵死亡相關(guān)，去鐵胺作為一種鐵螯合劑，具有拮抗甲基汞毒性的效應(yīng)，其機(jī)制可能與上調(diào)HIF-1α及GPx4從而抑制鐵死亡有關(guān)。