吳彥霖 陳雨琪 李趙繼 王若沁 石通國④ 陳衛(wèi)昌④

(蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，蘇州 215006)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界范圍內(nèi)常見的消化道惡性腫瘤之一?！?018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)》顯示，CRC發(fā)病率及死亡率分別位居全球第三和第二，且我國CRC發(fā)病率及死亡率逐年升高[1-3]。但目前針對中晚期CRC患者的治療效果并不理想[4]。腫瘤免疫療法已成為CRC治療的新熱點，其中，免疫細胞的抗腫瘤作用是腫瘤免疫治療的重要組成部分[5]。因此，分析腫瘤部位免疫細胞浸潤及功能狀態(tài)對患者預(yù)后評價和提高腫瘤免疫治療效果具有重要臨床價值。

γδT淋巴細胞是T淋巴細胞亞群，可通過不依賴主要組織相容性復(fù)合體相互作用的方式識別抗原，通過細胞毒性作用直接殺傷腫瘤細胞，快速啟動并建立有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答[6,7]。研究表明γδT淋巴細胞參與肺癌及前列腺癌等惡性腫瘤的抗腫瘤過程，但其表達變化與CRC發(fā)生發(fā)展及與預(yù)后的相關(guān)性報道較少[8,9]。

本研究通過建立CRC組織芯片，采用免疫組化法初步探究CRC組織中γδT淋巴細胞的表達變化及臨床意義。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 CRC組織芯片購于上海國家生物芯片工程中心，由101例CRC患者的癌組織及79例癌旁組織構(gòu)成。排除失訪及資料不全病例，本研究共納入90例CRC患者的癌組織及70例癌旁組織。所有患者于2006～2007年期間行CRC外科手術(shù)治療，且此前未接受過放療、化療及生物治療，排除其他惡性腫瘤病史，術(shù)后病理證實為CRC。隨訪時間為從手術(shù)日期開始到任何原因?qū)е禄颊咚劳龌蜃詈?次隨訪日期(2015年7月)截止?；颊呖偵嫫?overall survival，OS)為從手術(shù)日期開始至隨訪截止日期。臨床病理資料包括患者性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期?；颊吲R床分期依據(jù)第七版AJCC CRC標準[10]。

1.1.2主要試劑及儀器 鼠Anti-TCR gamma+TCR delta單克隆抗體(上海Abcam公司，貨號：ab171110)；兔抗人CD8單克隆抗體(上?；蚩萍脊荆浱枺篏T2112)；DAKO全自動免疫組化儀、SY W-25、ScanScope CS掃描儀、圖像分析程序(ScanScope TM)。

1.2方法

1.2.1免疫組化染色 組織芯片用二甲苯脫蠟后，依次置于無水乙醇2次，5 min/次，90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇中各5 min，ddH2O中5 min；3%過氧化氫處理20 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響。隨后置于DAKO自動免疫組化儀中采用檸檬酸鹽緩沖液(pH=6.0)進行抗原修復(fù)，修復(fù)完畢后進行免疫組化染色。

1.2.2免疫組化染色判讀 使用圖像分析程序在200倍高倍鏡視野下對掃描區(qū)域內(nèi)細胞染色進行評估，細胞變?yōu)樽攸S色及棕褐色為陽性。通過掃描及圖像分析得出區(qū)域內(nèi)陽性染色細胞數(shù)及面積，并計算出組織內(nèi)陽性細胞的密度(密度=陽性細胞數(shù)/區(qū)域面積)，CRC組織中γδT淋巴細胞密度中位數(shù)為1 233.10；CD8+T淋巴細胞密度中位數(shù)為127.44，以此將組織內(nèi)細胞的表達變化分為高表達組(>中位數(shù))及低表達組(≤中位數(shù))[11]。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，Wilcoxon秩和檢驗分析2種細胞在CRC及癌旁組織中的表達差異。γδT淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的表達變化與臨床病理因素的關(guān)系采用卡方檢驗或Fisher精確檢驗。Spearman法分析CRC組織中γδT淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞相關(guān)性。Kaplan-Meier法進行預(yù)后分析并進行Log-rank檢驗。COX比例風險回歸模型分析CRC的獨立危險因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CRC組織及癌旁組織中γδT淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的表達比較 γδT淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞在CRC組織及癌旁組織中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

2.2CRC組織內(nèi)γδT淋巴細胞及CD8+T淋巴細胞表達與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 γδT淋巴細胞表達水平變化與CRC臨床分期呈負相關(guān)(P=0.046)，而與CRC患者年齡、性別、腫瘤大小、N分期無關(guān)。CD8+T淋巴細胞表達水平與CRC患者年齡、性別、腫瘤大小、N分期、臨床分期均無明顯相關(guān)性(P>0.05,表2、圖1)。

2.3CRC組織中γδT淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析表明，CRC組織中，γδT淋巴細胞表達與CD8+T淋巴細胞表達呈正相關(guān)(r=0.472，P<0.001，表3)。

表1 CRC組織及癌旁組織中γδT淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的表達差異

表2 CRC組織γδT淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞表達與CRC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)

圖1 CRC組織γδT淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞表達(×200)Fig.1 Expressions of γδT lymphocytes and CD8+T lymphocytes in CRC tissues(×200)Note:A.High expression of γδT lymphocytes;B.Low expression of γδT lymphocytes;C.High expression of CD8+T lymphocytes;D.Low expression of CD8+T lymphocytes.

2.4CRC組織中γδT淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞表達變化與CRC患者預(yù)后的分析 Kaplan-Meier分析顯示，與γδT淋巴細胞高表達患者相比，γδT淋巴細胞低表達患者預(yù)后較差(Log-rankP=0.028)，而CD8+T淋巴細胞表達對預(yù)后影響的無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合評估γδT淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞表達變化對CRC患者預(yù)后的影響顯示，與CD8+T(-)/γδT(-)、CD8+T(+)/γδT(-)組相比，γδT淋巴細胞高表達組，即CD8+T(-)/γδT(+)(Log-rankP=0.039)、CD8+T(+)/γδT(+)(Log-rankP=0.113)組患者預(yù)后更佳(圖2)。

2.5γδT淋巴細胞是CRC預(yù)后的獨立危險因素 單變量COX分析結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、γδT淋巴細胞表達(HR：0.547，95%CI：0.316～0.948，P=0.032)是CRC預(yù)后的重要危險因素(表4)。而多變量COX風險回歸分析中，γδT淋巴細胞表達變化對預(yù)后的影響依然顯著(HR：0.536，95%CI：0.309～0.930，P=0.027，表5)。表明γδT淋巴細胞是評估CRC預(yù)后的獨立危險因素。

圖2 γδT淋巴細胞CD8+T淋巴細胞表達水平與CRC患者預(yù)后的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of expressions of γδT lymphocytes and CD8+T lymphocytes and prognosis of CRC patientsNote:γδT(+).High expression of γδT lymphocytes；γδT(-).Low expression of γδT lymphocytes；CD8+T(+).High expression of CD8+T lymphocytes；CD8+T(-).Low expression of CD8+T lymphocytes.

3 討論

目前，CRC患者的預(yù)后評價主要依賴于AJCC的腫瘤組織病理學(xué)標準或國際癌癥控制聯(lián)盟的TNM分類系統(tǒng)，而近年研究發(fā)現(xiàn)腫瘤免疫細胞浸潤與預(yù)后密切相關(guān)，并逐漸成為評估腫瘤患者預(yù)后的有效指標之一[12]。研究表明，γδT淋巴細胞作為人體重要的免疫細胞，其表達及功能在腫瘤發(fā)生發(fā)展和治療中發(fā)揮重要作用，受到廣泛關(guān)注。

本研究發(fā)現(xiàn)γδT淋巴細胞在CRC樣本中均有不同程度表達，且在CRC組織及癌旁組織中的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能是CRC組織及癌旁組織中不同γδT淋巴細胞亞群的表達差異所致。有研究表明，與CRC癌旁組織相比，CRC組織中Vδ1和Vδ2 T淋巴細胞表達稍有升高但差異不顯著[13]。Rong等[14]發(fā)現(xiàn)直腸癌組織中高表達Vδ1T淋巴細胞，癌旁組織中高表達Vδ2 T淋巴細胞，而VδT淋巴細胞在癌組織及癌旁組織中表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與本研究結(jié)果一致。

表4 CRC預(yù)后危險因素的COX單因素回歸分析

表5 CRC預(yù)后危險因素的COX多因素回歸分析

盡管γδT淋巴細胞表達在CRC組織及癌旁組織中變化不明顯，但其表達水平與患者預(yù)后密切相關(guān)。Kobayashi等[15]報道，自體γδT細胞經(jīng)體外活化、擴增及回輸治療有效延長1例晚期腎細胞癌患者生存期。在晚期乳腺癌免疫治療中，γδT淋巴細胞活化后同樣可有效抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，改善患者預(yù)后[16]。此外，在小鼠CRC模型中，γδT淋巴細胞不僅可抑制CRC原發(fā)灶的發(fā)生發(fā)展，還可抑制癌細胞向肝、肺等器官轉(zhuǎn)移[17]。Meraviglia等[13]發(fā)現(xiàn)，γδT淋巴細胞高表達的CRC患者5年無病生存的比例較低表達患者更高。本研究結(jié)果表明結(jié)直腸癌組織內(nèi)γδT淋巴細胞表達水平與結(jié)直腸癌臨床分期呈負相關(guān)，并與患者預(yù)后呈正相關(guān)。因此，腫瘤內(nèi)浸潤的γδT淋巴細胞水平可作為評估結(jié)直腸癌患者預(yù)后的指標。

CD8+T淋巴細胞作為免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細胞，激活后可分化為效應(yīng)T淋巴細胞，即細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes，CTLs)，通過特異性識別殺傷表達MHCⅠ的腫瘤細胞。CTLs在趨化因子作用下浸潤至腫瘤部位直接殺傷腫瘤細胞。研究發(fā)現(xiàn)CD8+T淋巴細胞參與CRC、乳腺癌等多種惡性腫瘤的抗腫瘤過程[18,19]。CD8+T淋巴細胞的表達水平與CRC患者的預(yù)后相關(guān)，且CD8+T淋巴細胞高表達的患者較低表達患者預(yù)后更佳[20-22]。本研究結(jié)果提示CD8+T淋巴細胞表達與CRC臨床分期、N分期、患者預(yù)后不相關(guān)。未來可擴大CRC組織樣本量、應(yīng)用多色免疫熒光染色等方法進一步探討CD8+T淋巴細胞在CRC發(fā)病機制中的作用及其與預(yù)后的相關(guān)性。研究表明CD8+T淋巴細胞可作為評估CRC患者預(yù)后的重要生物學(xué)指標[23,24]。故本研究分析γδT淋巴細胞與CD8+T淋巴細胞的關(guān)系，結(jié)果顯示CRC組織內(nèi)γδT淋巴細胞表達與CD8+T淋巴細胞表達呈正相關(guān)，表明2種免疫細胞均可能參與CRC的發(fā)生發(fā)展，影響CRC患者預(yù)后。

在本研究中，Kaplan-Meier預(yù)后分析顯示無論單獨分析γδT淋巴細胞還是聯(lián)合分析γδT淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的表達在CRC患者預(yù)后評價中的臨床價值，結(jié)果均表明γδT淋巴細胞高表達組較低表達組預(yù)后更佳。此外，COX回歸模型分析表明γδT淋巴細胞是評估CRC患者預(yù)后的獨立危險因素。提示γδT淋巴細胞是一種新的、有價值的評估CRC學(xué)預(yù)后的生物學(xué)標志物，與Meraviglia等[13]的研究結(jié)論一致。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)CRC組織中γδT淋巴細胞表達水平與CRC患者臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)。后續(xù)擬擴大組織樣本量以及采用多色熒光免疫組化和流式細胞術(shù)等方法進一步研究γδT淋巴細胞在CRC組織中的表達及其對CRC患者預(yù)后評價的臨床價值，為CRC免疫治療提供新思路。