鄧淑文 夏紅星 (南華大學附屬南華醫(yī)院疼痛科，衡陽 421002)

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，胃癌晚期患者的5年生存率較低，因此研究胃癌發(fā)生發(fā)展過程中潛在的分子機制對尋找有效的治療方案十分重要[1,2]。人GTP結(jié)合蛋白4 (GTP binding protein,GTPBP4)是GTPBPs家族成員，主要位于人染色體10p15-p14區(qū)域，是長度為12 285的線性DNA序列，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn)敲低GTPBP4基因表達能夠顯著抑制肝癌細胞生長，GTPBP4在結(jié)直腸癌中表達顯著上調(diào)，與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)[4,5]。Li等[6]關(guān)于胃癌的實驗表明，GTPBP4在胃癌組織和細胞中表達顯著增強，通過調(diào)節(jié)p53活性促進胃癌進展。眾多信號通路與胃癌進展相關(guān)，本研究進一步探討GTPBP4與胃癌發(fā)病的關(guān)系，并探討其在胃癌中的具體調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1材料 人胃黏膜上皮細胞株和胃癌細胞株均購自中科院上海生命科學研究院；RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen；順鉑購自山東齊魯制藥；TRIzol試劑盒購自Gibco；RT-PCR試劑盒購自大連寶生物；PCR引物序列由華大基因合成；BCA蛋白定量試劑盒購自Sigma；Western blot抗體購自Abcam；MTT溶液、Matrigel基質(zhì)膠購自北京索萊寶；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自貝博生物；MTX-211 EGFR/PI3K/AKT通路特異性抑制劑購自Selleck。

1.2方法

1.2.1GTPBP4基因沉默及過表達重組質(zhì)粒構(gòu)建 采用NCBI查詢?nèi)薌TPBP4 mRNA序列(KJ8985 11.1)，BLOCK-iTTMRNAi Designer網(wǎng)站在線設計GTPBP4的shRNA序列(5′-CACCGGATGTGCACAGTGATCAAGACGAATCTTGATCACTGTGCACATC-C-3′)。參照GenBank基因序列，采用Primer 5.0設計GTPBP4引物(F：5′-TCGTTGATGTCTGTGAG-CTTC-3′，R：3′-GGTGCTTCTAGACAGTTGTTCA-5′)，并分別在上下游引物加上EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點。經(jīng)酶切后連接至基因片段，轉(zhuǎn)至DH 5α大腸桿菌克隆，DNA試劑盒提取重組載體，-80℃保存。

1.2.2細胞培養(yǎng)及分組轉(zhuǎn)染 將人胃癌細胞株MGC-803、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45及正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基。qRT-PCR和Western blot檢測各細胞株GTPBP4表達，篩選胃癌細胞中GTPBP4表達量最高的細胞株。取對數(shù)生長期胃癌細胞株并分為6組：Blank組(不做處理)、陰性對照組(轉(zhuǎn)染含無關(guān)序列的重組質(zhì)粒)、GTPBP4 shRNA組(轉(zhuǎn)染含GTPBP4 shRNA的重組質(zhì)粒)、GTPBP4過表達組(轉(zhuǎn)染含GTPBP4 片段的重組質(zhì)粒)、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組(針對EGFR和PI3K基因靶點的EGFR/PI3K/AKT通路抑制劑 MTX-211處理細胞)、Combined treatment組(EGFR/PI3K/AKT通路抑制劑聯(lián)合GTPBP4 shRNA處理)。轉(zhuǎn)染時將對數(shù)生長期細胞接種于6孔板，調(diào)整細胞密度為2×105個/孔，按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后取對數(shù)生長期細胞，給予順鉑處理并進行后續(xù)實驗。

1.2.3半數(shù)抑制濃度(IC50)測定 取100 μl細胞(2 × 105個/ml)接種于96孔板，給予順鉑(1 mg/ml,生理鹽水溶解)刺激。RPMI1640培養(yǎng)液稀釋順鉑至終濃度分別為1、2、4、8、16、32、64 μg/ml，100 μl/孔，各濃度設4個復孔，同時設陰性對照孔，加入等量不含順鉑的培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后加入MTT溶液 (5 mg/ml)，20 μl/孔，孵育4 h后加入150 μl DMSO，振蕩10 min。全自動酶標儀測定490 nm 處吸光度。細胞生長抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100%。計算順鉑對胃癌細胞MKN-45的IC50。

1.2.4qRT-PCR檢測基因相對表達水平 采用TRIzol試劑盒一步法提取總RNA，取3 μg總RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行反轉(zhuǎn)錄。按照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行qRT-PCR檢測，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達水平。

1.2.5Western blot檢測蛋白相對表達 取對數(shù)生長期細胞進行實驗，將200 μl含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液加入培養(yǎng)孔。細胞離心后采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，50 μg/孔行SDS-PAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封閉后加入GTPBP4、Bax、Bcl-2、EGFR、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT兔抗人一抗，4℃孵育過夜，TBST沖洗后加入山羊抗兔二抗IgG，37℃孵育1 h，TBST沖洗，加入ECL反應液反應1 min，觀察結(jié)果。蛋白相對表達量為目標條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值。

表1 引物序列

1.2.6MTT法測定細胞增殖活力 轉(zhuǎn)染后1～5 d取順鉑處理的胃癌細胞，20 μl/孔加入5 g/L MTT溶液培養(yǎng)4 h，100 μl/孔加入DMSO，充分振蕩。酶標儀測定490 nm處吸光度，繪制生長曲線。

1.2.7Transwell細胞侵襲實驗 采用MEM培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，取100μl充分混勻的Matrigel膠加入Transwell小室上室，室溫放置2 h。轉(zhuǎn)染后的細胞以DMEM培養(yǎng)基重懸，稀釋至3×105個/ml，將100 μl細胞懸液加入下室，同時加入600 μl含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。連續(xù)培養(yǎng)24 h后行結(jié)晶紫染色并在光學顯微鏡下拍照，計算跨膜細胞數(shù)。隨機選取3～5個視野,ImageJ軟件計算下室被結(jié)晶紫染色的細胞數(shù)。

1.2.8流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測MKN-45細胞凋亡情況。PBS洗滌細胞，2 000 r/min離心5 min，加入500 μl結(jié)合緩沖液，調(diào)整細胞密度為4×105個/ml，加入5 μl Annexin V-FITC并混勻，避光室溫孵育10 min。加入5 μl PI混勻，5 min內(nèi)流式細胞術(shù)檢測波長480、530 nm處檢驗FITC，>575 nm處檢測PI。

2 結(jié)果

2.1GTPBP4在胃癌細胞中的表達情況 與正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1相比， 人胃癌細胞株中GTPBP4表達上升(P<0.05)，表明GTPBP4在胃癌細胞中過表達。Vimentin蛋白在SGC-7901細胞中表達最高，N-cadherin和MMP-2蛋白在MKN-45細胞中表達最高(P<0.05)。4種人胃癌細胞株中，MKN-45細胞GTPBP4表達最高(P<0.05)，且上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程度最高，因此選取MKN-45作為實驗細胞株，見圖1。

2.2MKN-45細胞株順鉑誘導濃度確定 隨順鉑濃度升高，MKN-45細胞抑制率逐漸上升，當順鉑濃度為21.36 μg/ml時，MKN-45細胞的抑制率接近50%，因此，認為順鉑對MKN-45細胞的IC50為 21.36 μg/ml。

2.3順鉑下調(diào)胃癌細胞GTPBP4表達 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，順鉑處理后MKN-45細胞GTPBP4表達顯著下降(P<0.05)，見圖2。

2.4GTPBP4基因沉默抑制EGFR/PI3K/AKT信號通路激活 與Blank組相比，GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達顯著降低，且Combined treatment組抑制效果最為顯著(P<0.05)。GTPBP4過表達組EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達顯著提高(P<0.05)，表明該通路被激活。Blank組和NC組各指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.5GTPBP4基因沉默通過EGFR/PI3K/AKT信號通路抑制順鉑誘導的胃癌細胞增殖活力與Blank組相比，GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組細胞活力顯著降低，且Combined treatment組細胞活力降低最為顯著(P<0.05)，GTPBP4過表達組細胞增殖活力顯著增強(P<0.05)。Blank組和NC組各時間點差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

圖1 GTPBP4表達測定和胃癌細胞株篩選Fig.1 Detection of GTPBP4 expression and screening of gastric cancer cell lineNote:Compared with GES-1,*.P<0.05.

圖2 MKN-45細胞順鉑處理前后GTPBP4表達Fig.2 GTPBP4 expression in MKN-45 cells before and after treating by cisplatinNote:Compared with before treatment,*.P<0.05;1.Before treatment；2.After treatment.

圖3 各組EGFR/PI3K/AKT信號通路相關(guān)因子表達

圖4 各組細胞不同時間點細胞增殖活力Fig.4 Cell proliferative activity in each group at different time pointsNote:Compared with Blank group,*.P<0.05；compared with Combined treatment group,#.P<0.05.

2.6GTPBP4基因沉默介導EGFR/PI3K/AKT信號通路抑制胃癌細胞侵襲 與Blank組相比，GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組細胞侵襲數(shù)顯著減少，且Combined treatment組減少最為顯著(P<0.05)，GTPBP4過表達組細胞侵襲顯著增強(P<0.05)。Blank組和NC組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖5。

2.7GTPBP4沉默可抑制EGFR/PI3K/AKT信號通路引起順鉑誘導的胃癌細胞凋亡 與Blank組相比，順鉑處理后GTPBP4 shRNA組、EGFR/PI3K/AKT inhibitor組及Combined treatment組胃癌細胞凋亡率明顯上升，Bax、Caspase-3表達上調(diào)，且Combined treatment組上升最為顯著 (P<0.05)，GTPBP4過表達組凋亡率明顯下降，Bcl-2表達下調(diào)(P<0.05)。表明GTPBP4基因沉默可促進順鉑誘導的胃癌細胞凋亡。Blank組和NC組細胞凋亡率及蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖6。

圖5 各組細胞侵襲能力(×200)

圖6 各組細胞凋亡情況

3 討論

GTPBP4可調(diào)控細胞的增殖和周期，其在肝癌、結(jié)腸癌中表達失調(diào)，促進胃癌進展[6-9]。但GTPBP4調(diào)控胃癌發(fā)病的分子機制尚未完全明確，本研究從分子生物學角度出發(fā)，探討基因與下游信號通路對胃癌的影響，結(jié)果證實GTPBP4基因可通過EGFR/PI3K/AKT信號通路影響胃癌細胞生物學行為。

順鉑是目前晚期胃癌患者的一線化療藥物，與DNA交聯(lián)促進DNA雙鏈斷裂從而誘導胃癌細胞凋亡[10-13]。本研究進一步探討順鉑誘導胃癌細胞凋亡過程中的分子網(wǎng)絡，對順鉑處理后胃癌細胞中GTPBP4表達進行檢測，相比于處理前，順鉑處理后可顯著抑制胃癌細胞GTPBP4表達。EGFR信號通路是胃癌發(fā)病和進展的重要通路，研究表明，敲低ADAM17基因可抑制EGFR信號通路激活進而抑制胃癌細胞增殖和侵襲[14,15]。PI3K/AKT信號通路被證實在胃癌細胞中顯著激活，抑制該通路激活可促進胃癌細胞凋亡[16,17]。本研究對EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達進行檢測發(fā)現(xiàn)，沉默GTPBP4可抑制EGFR/PI3K/AKT通路相關(guān)因子表達并對胃癌細胞進行調(diào)控，與既往研究結(jié)論一致。進一步證實EGFR/PI3K/AKT通路的活化情況受GTPBP4基因表達影響。

對各組細胞增殖活力及侵襲情況進行檢測發(fā)現(xiàn)，相比于Blank組，GTPBP4基因沉默組及EGFR/PI3K/AKT通路抑制劑組細胞增殖及侵襲顯著降低，且聯(lián)合處理效果更為明顯。Caspase-3是介導細胞凋亡的關(guān)鍵蛋白水解酶，也是凋亡執(zhí)行過程中的關(guān)鍵效應分子[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)沉默Glut1基因能夠促進結(jié)直腸癌細胞中Caspase-3表達，抑制細胞增殖分化，促進凋亡[21]。另有研究證實CCNB1基因沉默可調(diào)控胰腺癌細胞Caspase-3表達[22]。本研究采用Western blot及qRT-PCR對各組細胞凋亡相關(guān)因子進行檢測發(fā)現(xiàn)，沉默GTPBP4或抑制EGFR/PI3K/AKT通路可促進Bax及Caspase-3表達，下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2表達，進一步證實GTPBP4對胃癌細胞增殖凋亡的影響是通過調(diào)控Caspase-3及凋亡相關(guān)因子表達實現(xiàn)的。流式細胞術(shù)結(jié)果進一步表明，沉默GTPBP4或抑制EGFR/PI3K/AKT通路可進一步促進順鉑誘導的胃癌細胞凋亡。

綜上所述，GTPBP4基因沉默可抑制EGFR/PI3K/AKT通路激活進而抑制胃癌細胞增殖、侵襲，促進順鉑誘導的胃癌細胞凋亡，在胃癌診斷及分子靶向治療中具有重要意義。本研究也存在一定局限性，如證實GTPBP4在胃癌中作用的方法可進一步完善，可進一步探討影響GTPBP4表達的上游調(diào)控因子。課題組將進一步增加裸鼠荷瘤等實驗驗證GTPBP4的作用，探討影響GTPBP4表達的上游miRNA等。