趙 巍 劉學(xué)政 張明珠 李曉涵 支 勇② (天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300000)

伴隨著社會整體老齡化的發(fā)展，心臟和腎臟疾病的發(fā)病率逐年上升[1]。荷蘭學(xué)者Bongartz[2]在2005年提出“心腎綜合征”，其主要特征為腎功能不全并且伴隨心力衰竭。近年來，心腎綜合征的發(fā)病率顯著上升，但臨床上尚無有效治療手段，患者死亡率較高，從而使得心腎綜合征備受關(guān)注。心腎綜合征疾病的血流動力學(xué)紊亂、腎臟功能受損導(dǎo)致體內(nèi)尿毒癥毒素的聚積，最終引發(fā)心臟以及腎臟共同衰竭，因此抑制心肌以及腎臟纖維化，改善心臟及腎臟功能是心腎綜合征的防治重點[3-5]。相關(guān)研究報道，參附強心丸可以通過調(diào)控腎素原受體從而抑制心腎細胞凋亡，達到保護心臟以及腎臟的作用[6]。此外，參附強心丸對腹主動脈縮窄致慢性心衰大鼠心肌 Bcl-2 表達上調(diào)起到抗心衰以及抑制大鼠心肌纖維化的作用[7]。但是參附強心丸對于心腎綜合征腎臟功能的影響以及通路研究報道較少。因此，本研究采用相關(guān)文獻報道的手術(shù)方法構(gòu)建 2 型心腎綜合征大鼠模型[8]，模擬臨床2型心腎綜合征病理特點，探討參附強心丸對 2型心腎綜合征大鼠腎臟功能的影響并闡述其相關(guān)的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 參附強心丸(天津中新藥業(yè)集團達仁堂制藥廠，生產(chǎn)批號：2018062438)；SPF級SD大鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0011；IS試劑盒購自上海美軒生物科技有限公司；Ucr試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司；Scr試劑盒以及BUN試劑盒購于江蘇菲亞生物科技有限公司；ECL Plus 超敏發(fā)光液、RPMI1640培養(yǎng)基、考馬斯亮藍試劑購自北京索萊寶公司；TRIzol試劑盒購自invitrogen公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液Ⅰ、HIF一抗、VEGF一抗、Notch1一抗以及GAPDH一抗購于英國Abcam公司；山羊血清以及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS)；高速離心機(Eppendorf，德國)；多功能酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國)； ABI 7500實時熒光定量PCR儀( ABI，美國)；轉(zhuǎn)膜儀及電泳儀(北京六一儀器廠)；冷凍冷藏兩用冰箱(Siemens，德國)。

1.2方法

1.2.1動物建模、分組及給藥 采用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，待大鼠麻醉后固定大鼠，下氣管插管，并使用呼吸機輔助呼吸，沿胸骨左緣第3到4肋間切開皮膚、鈍性分離肌肉組織以暴露心臟，對左冠狀動脈前降支進行結(jié)扎，誘發(fā)心梗。2周后采用同樣方法麻醉大鼠，沿腹中線切開，切除右腎以及左腎動脈前上支、前下支、背支結(jié)扎的5/6腎切除術(shù)，從而誘發(fā)腎功能不全。取10只大鼠在同樣的時間點進行心包膜及腎包膜撕開并不結(jié)扎或者切除的假手術(shù)，作為對照組(假手術(shù)對照組)。將造模成功的30只大鼠隨機分為3組：模型組(心腎綜合征組)、參附強心丸治療組(心腎綜合征+參附強心丸)、卡托普利組(心腎綜合征+卡托普利)，每組10只。本研究中采用灌胃方式給藥，參附強心丸治療組給藥劑量按照大鼠體重計算(3.3 g/kg)，卡托普利組(2.3 mg/kg)。假手術(shù)組以及模型對照組給予等量生理鹽水。

1.2.2生化指標(biāo)檢測 通過心尖取血的方法收集各組大鼠的血液標(biāo)本，4℃、5 000 r/min離心10 min，去上清，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎么x籠對大鼠尿液進行收集，計算24 h尿液量，各組大鼠尿液標(biāo)本置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用相?yīng)試劑盒按照操作說明書對于BUN、IS、Scr以及Ucr水平進行檢測。

1.2.3HE及Masson染色 各組大鼠經(jīng)心尖取血，開胸、開腹取出腎臟，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h后脫水、包埋以及切片處理。按標(biāo)準(zhǔn)步驟對各組切片進行HE以及Masson染色。

1.2.4α-SMA及Collagen Ⅰ免疫組化染色 將1.2.3制備的切片按照免疫組化標(biāo)準(zhǔn)步驟，進行α-SMA及Collagen Ⅰ染色。采用倒置顯微鏡對染色結(jié)果進行拍照記錄。有棕色細絲網(wǎng)或顆粒為陽性表達，采用IPWIN60圖像分析軟件對結(jié)果進行分析。

1.2.5qRT-PCR檢測檢測腎臟組織HIF-VEGF-Notch信號通路相關(guān)mRNA表達 收集各組大鼠腎臟組織，TRIzol試劑盒提取總RNA，檢測RNA濃度及純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：75℃ 預(yù)變性120 s;95℃ 變性 60 s;60℃ 退火 50 s;72℃延伸60 s，共40個循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，采用ABI 7500實時熒光定量PCR儀對擴增結(jié)果進行分析,引物序列見表1。

1.2.6Western blot檢測腎臟組織HIF-VEGF-Notch信號通路相關(guān)蛋白表達 收集各組大鼠腎臟組織，加入RIPA裂解20 min，離心3 min，收集上清。采用BCA法對提取蛋白濃度進行測定。將蛋白樣品置于100℃水浴變性3 min，各樣品取15 μg 蛋白，采用SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫條件下封閉1.5 h，加入稀釋的HIF一抗(1：2 000)、VEGF一抗(1∶1 000)、Notch1一抗( 1∶1 000)、GAPDH一抗( 1∶2 500)，4℃搖床孵育過夜。采用PBST將PVDF膜洗凈并加入HRP標(biāo)記的IgG，孵育后ECL顯影拍照記錄，采用Image J軟件分析條帶灰度值，各目的條帶灰度與相應(yīng)的GAPDH條帶灰度比值作為蛋白相對表達量。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1參附強心丸對腎臟相關(guān)功能指標(biāo)的影響 與對照組比較，模型組大鼠BUN、Scr水平均明顯升高(P<0.01)，IS、Ucr水平明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，參附強心丸組大鼠BUN、Scr水平明顯降低(P<0.05)，IS、Ucr水平明顯升高(P<0.05)；參附強心丸組與卡托普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

2.2大鼠腎臟組織染色 模型組大鼠腎小管上皮細胞萎縮程度高于對照組，參附強心丸組大鼠腎小管上皮細胞萎縮程度低于模型組大鼠，見圖2。

2.3大鼠腎臟組織α-SMA以及Collagen Ⅰ的表達 相比于模型組，對照組大鼠腎臟α-SMA以及Collagen Ⅰ 表達顯著減少(P<0.01)，參附強心丸組大鼠腎臟與模型組相比α-SMA以及Collagen Ⅰ 表達降低(P<0.05)，見表2、圖3。

圖1 各組大鼠生化指標(biāo)比較Fig.1 Comparison of biochemical index of rats in each groupNote:*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001.

2.4HIF-VEGF-Notch信號通路相關(guān)mRNA轉(zhuǎn)錄水平 與模型組比較，對照組大鼠HIF、VEGF以及Notch1的mRNA表達水平均有顯著升高(P<0.05)；與模型組相比， 參附強心丸組大鼠HIF、VEGF以及Notch1的mRNA表達明顯升高(P<0.05)；參附強心丸組與卡托普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

2.5HIF-VEGF-Notch信號通路相關(guān)蛋白的表達水平 與模型組比較，對照組大鼠HIF、VEGF及Notch1蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，參附強心丸組大鼠HIF、VEGF及Notch1蛋白表達明顯升高(P<0.05)；參附強心丸組與卡托普利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖2 各組大鼠HE及Masson染色Fig.2 HE and Masson staining of rats in each group

表2 各組大鼠α-SMA及Collagen Ⅰ染色結(jié)果

圖4 HIF、VEGF以及Notch1的mRNA表達水平Fig.4 mRNA expression levels HIF,VEGF and Notch1Note:Compared with Model,*.P<0.05,**.P<0.01.

圖5 HIF、VEGF以及Notch的蛋白表達水平Fig.5 Protein expression levels of HIF,VEGF and Notch1Note:Compared with Model,*.P<0.05,**.P<0.01.

3 討論

心腎綜合征是由于心臟或腎臟的急慢性功能不全而導(dǎo)致另一臟器功能不全的疾病[2]。近年來，中藥應(yīng)用于心腎綜合征疾病的研究受到眾多研究者的重視，其中復(fù)方制劑更是研究的重點[9,10]。參附強心丸是一種中藥復(fù)方制劑，由人參、豬苓、附子、桑白皮、大黃等作為主要成分研制而成，在強心利水、益陽補氣方面具有較好療效。此外，參附強心丸在慢性心力衰竭等心臟疾病治療中應(yīng)用廣泛，可用于改善心臟功能，相關(guān)研究表明，參附強心丸可改善心腎綜合征大鼠心肌纖維化程度，且具有抗心衰作用，提示參附強心丸可以改善心腎綜合征的心臟功能[11，12]。在心腎綜合征疾病治療中參附強心丸對于腎臟功能的影響以及相關(guān)的通路研究報道較少，本研究通過構(gòu)建心腎綜合征大鼠模型探討參附強心丸對2型心腎綜合征的影響以及其相應(yīng)可能的機制進行探索。

本研究結(jié)果顯示，參附強心丸組BUN、Scr水平顯著低于模型組，IS以及Ucr水平顯著高于模型組。組織纖維化作為心腎綜合征惡性循環(huán)的一個重要環(huán)節(jié)是研究重點。腎纖維化小鼠腎臟組織高表達α-SMA以及Ⅰ型膠原[13，14]。參附強心丸組大鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)紊亂程度、α-SMA以及Ⅰ型膠原比例顯著低于模型組，以上結(jié)果均表明參附強心丸對于腎臟有明顯的保護作用，經(jīng)過治療后，腎臟功能有明顯恢復(fù)。

研究表明，Notch信號通路在阿霉素腎病腎小球硬化過程中被激活高表達，且在腎臟組織中HIF-VEGF-Notch信號通路相關(guān)因子表達升高，提示在心腎綜合征所引發(fā)的腎組織損傷中，該通路可能參與調(diào)節(jié)腎臟功能[15]。HIF-1α是參與細胞氧代謝調(diào)節(jié)的重要因子之一，可通過調(diào)節(jié)下游靶基因的表達從而實現(xiàn)對細胞的糖轉(zhuǎn)運、能量的代謝、血管與紅細胞的生成等的調(diào)控，并且減輕低氧微環(huán)境對于細胞造成的損傷[16]。相關(guān)研究證明，在急性腎損傷、單側(cè)腎切除、糖尿病等模型研究中，HIF活化并且高表達可延緩腎損傷[17]。VEGF作為HIF的下游靶基因，在HIF激活后，VEGF的表達也會有顯著升高[18]。研究表明，糖尿病誘發(fā)的腎臟損傷過程中腎臟組織的VEGF呈現(xiàn)出表達上升的現(xiàn)象[19,20]。在發(fā)育成熟的正常組織中Notch 受體和配體呈現(xiàn)出低水平表達，但是在組織受到損傷時，Notch 受體和配體的活性增強，表現(xiàn)為Notch 基因的表達水平增高[21]。本研究結(jié)果顯示，參附強心丸組大鼠在HIF、VEGF以及Notch的mRNA與蛋白的表達水平明顯高于模型組，提示參附強心丸對于2型心腎綜合征大鼠腎臟的保護作用可能是通過促進HIF-VEGF-Notch信號通路實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究通過建立心腎綜合征模型大鼠驗證了參附強心丸可能通過促進HIF-VEGF-Notch的表達，從而起到對心腎綜合征大鼠腎臟的保護作用。然而，由于心腎綜合征疾病發(fā)病過程以及藥物治療的作用機制復(fù)雜，且HIF-VEGF-Notch信號通路涉及因子眾多，因此對于這一治療過程的具體作用機制仍需進一步探索。