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        miR-150缺失通過細(xì)胞免疫應(yīng)答促進(jìn)Ⅰ型糖尿病的發(fā)生①

        2020-12-23 12:38:34高麗清李鈺銳李潔心劉美麗段一碩趙亞林李曉曉王勇滿李秋飛鄭全輝
        中國(guó)免疫學(xué)雜志 2020年22期
        關(guān)鍵詞:胰島抗體小鼠

        高麗清 梁 靖 張 爽 李鈺銳 李潔心 劉 瀟 劉美麗 段一碩 趙亞林 張 琦 李曉曉 張 冰 王勇滿 李秋飛 鄭全輝

        (華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,唐山 063210)

        目前研究表明,Ⅰ型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus,T1DM)是由于機(jī)體免疫自穩(wěn)功能失常導(dǎo)致的一類自身免疫性疾病,由抗體介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答對(duì)胰島β細(xì)胞的攻擊是T1DM發(fā)病的重要原因[1,2]。microRNAs是一類具有負(fù)向基因表達(dá)調(diào)節(jié)功能的短鏈非編碼RNA(約22個(gè)核苷酸),在機(jī)體多種免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能發(fā)揮中具有重要調(diào)控作用[3]。miR-150在淋巴細(xì)胞中高表達(dá)。已有研究表明,miR-150在T1DM患者血清/血漿、外周血單個(gè)核細(xì)胞和胰島等組織中表達(dá)降低,提示miR-150在T1DM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,然而其作用機(jī)制目前尚未明確[4]。既往研究發(fā)現(xiàn),miR-150缺失導(dǎo)致自然殺傷性T細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生增加,促進(jìn)小鼠T1DM的發(fā)生[5]。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)處理T1DM小鼠模型,進(jìn)一步研究了miR-150對(duì)T1DM相關(guān)自身抗體以及效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的影響,以期為T1DM的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究提供新的線索。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 miR-150基因敲除(miR-150 knockout,150KO)和野生型正常對(duì)照(wild type,WT)的C57BL/6小鼠購自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor,ME,USA),并在華北理工大學(xué)SPF級(jí)鼠房飼養(yǎng)、繁殖。實(shí)驗(yàn)選取4~8周齡雄性150KO和WT小鼠,每組6~8只。小鼠實(shí)驗(yàn)操作按照華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行。miR-150 敲除小鼠基因型鑒定采用下列引物:F:5′-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3′,R:5′-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3′。miR-150KO小鼠和WT小鼠產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為262 bp和866 bp。

        1.1.2主要試劑與儀器 STZ購自Sigma公司;胰島細(xì)胞自身抗體(ICA)和谷氨酸脫羧酶自身抗體(GADA)檢測(cè)ELISA試劑盒購自MultiSciences公司;熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD4(RM4-5)、抗CD8(53-6.7)、抗B220(RA3-6B2)、抗IL-4(11B11)、抗IFN-γ(XMG1.2)抗體購自美國(guó)BD公司;抗小鼠Foxp3(FJK-16s)抗體和細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒購自美國(guó)eBiosciences公司;引物由上海生物工程服務(wù)公司合成;血糖儀購自瑞士羅氏公司。

        1.2方法

        1.2.1小鼠T1DM模型制備 STZ溶于0.1 mol/L pH4.5的檸檬酸緩沖液(Vehicle,Veh),實(shí)驗(yàn)組選擇雄性野生型C57BL/6和miR-150KO小鼠,STZ 150 mg/kg 腹腔注射(WT+STZ;150KO+STZ),對(duì)照組小鼠注射等量溶劑(WT+Veh;150KO+Veh)。注射當(dāng)天記為第0天,記錄小鼠血糖值,以后每隔3 d分別測(cè)量,連續(xù)記錄2周。血糖水平連續(xù)2次≥13.8 mmol/L(250 mg/dl)時(shí)診斷為糖尿病。

        1.2.2小鼠基因型檢測(cè) 提取miR-150基因敲除小鼠(150KO)和野生型正常對(duì)照小鼠(WT)鼠尾DNA,PCR擴(kuò)增檢測(cè)其基因型。

        1.2.3ELISA檢測(cè)小鼠ICA和GADA水平 STZ注射2周后,摘除眼球取血約1 ml至EP管,室溫自然凝固20 min,3 000 r/min離心20 min。加入樣品稀釋液40 μl以及樣品10 μl于相應(yīng)抗體包被板,37℃溫育30 min,棄去液體加入洗滌液洗板5次拍干。加入酶標(biāo)試劑50 μl,重復(fù)上述溫育,洗板,拍干。加入顯色劑37℃避光顯色15 min,450 nm處測(cè)量吸光度(OD)。

        1.2.4流式細(xì)胞術(shù)分析 分別取STZ處理的150KO和WT小鼠脾臟,在含PBS的培養(yǎng)皿中研磨成單細(xì)胞懸液。4℃離心收集細(xì)胞并采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞,進(jìn)一步采用PBS離心、洗滌2次后重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),各組取1×106個(gè)細(xì)胞,首先加入Fc受體非特異性封閉抗體2.4G2于4℃封閉10 min,加入熒光素標(biāo)記抗體4℃染色30 min,PBS離心洗滌2次后上機(jī)檢測(cè),采用FlowJo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。對(duì)于Foxp3和細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)染色,收集培養(yǎng)細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞表面染色后經(jīng)冷PBS洗滌,用新鮮配制的固定/打孔液重懸細(xì)胞,加入2.4G2 4℃封閉10 min,直接加入抗小鼠Foxp3、IFN-γ、IL-4和IL-17抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色,4℃避光孵育30 min,固定,打孔液洗滌細(xì)胞2次后進(jìn)行流式分析。

        2 結(jié)果

        2.1小鼠基因型鑒定 結(jié)果如圖1所示,150KO小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長(zhǎng)度為262 bp的DNA片段,WT小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長(zhǎng)度為866 bp的DNA片段。

        圖1 150KO和WT小鼠基因型Fig.1 Genotype of 150KO and WT mice

        2.2miR-150缺失加速小鼠T1DM的發(fā)生 如圖2A所示,實(shí)驗(yàn)期間溶劑處理組WT和150KO小鼠平均血糖均為正常水平且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STZ處理的WT小鼠的血糖水平從0~15 d緩慢升高,至STZ處理后第9天血糖水平明顯高于溶劑處理組。而150KO小鼠在STZ處理后僅3 d血糖水平顯著升高,且在隨后的3~15 d內(nèi)始終顯著高于STZ處理的WT小鼠(P<0.01)。與血糖水平變化一致。在STZ處理后3~15 d后,150KO小鼠的T1DM發(fā)生率明顯高于WT小鼠(圖2B)。

        2.3STZ處理不增加150KO小鼠自身抗體水平 如圖3所示,與溶劑處理WT小鼠相比,溶劑處理150KO小鼠ICA和GADA水平均顯著升高 (P<0.01)。但STZ處理只提高WT小鼠ICA和GADA水平,對(duì)150KO小鼠ICA和GADA水平影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

        圖2 miR-150缺失加速STZ誘導(dǎo)的T1DM發(fā)生Fig.2 miR-150 deletion accelerates onset of T1DM induced by STZNote:A.Compared with WT mice from day 3,**.P<0.01;B.Compared with WT+STZ,##.P<0.01.

        圖3 STZ處理對(duì)150KO小鼠自身抗體水平的影響Fig.3 Effect of STZ treatment on levels of 150KO mice autoantibodiesNote:**.P<0.01.

        2.4STZ處理的150KO小鼠Treg細(xì)胞顯著減少 如圖4所示,與WT小鼠相比, 150KO小鼠CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B220+B細(xì)胞無顯著變化(P>0.05),但Treg比率顯著降低(P<0.05)。

        圖4 STZ處理150KO小鼠脾臟中Treg細(xì)胞顯著減少Fig.4 Decreased Treg in spleen of STZ-treated 150KO miceNote:A.Percentage of CD4+T cells,CD8+T cells and B220+B cells in spleen;B.Percentage of CD4+Foxp3+Tregs in spleen;*.P<0.05.

        圖5 STZ處理的150KO小鼠CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-17表達(dá)顯著上調(diào)Fig.5 Significantly increased IFN-γ and IL-17 expression in CD4+T cells of STZ-treated 150KO miceNote:*.P<0.05.

        2.5STZ處理的150KO小鼠CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-17表達(dá)顯著上升 如圖5所示,與WT小鼠CD4+T細(xì)胞相比,150KO小鼠IL-4陽性的CD4+T細(xì)胞比率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但I(xiàn)FN-γ和IL-17陽性的CD4+T細(xì)胞比率顯著上升(P<0.05)。

        3 討論

        研究發(fā)現(xiàn),由自身抗體和效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)胰島β細(xì)胞產(chǎn)生的特異免疫應(yīng)答損傷在T1DM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6]。多種自身抗體如ICA、GADA和胰島素抗體(IAA)已被作為T1DM的診斷指標(biāo)廣泛應(yīng)用于臨床[7]。抗CD20抗體(利妥昔單抗)已被證明可通過剔除B細(xì)胞延緩非肥胖糖尿病(non-obesediaketic,NOD)小鼠和新發(fā)病患者T1DM進(jìn)展[8]。在細(xì)胞免疫應(yīng)答中,CD4+T細(xì)胞通過識(shí)別T1DM易感相關(guān)HLAⅡ類分子提呈的抗原肽,活化產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子,在T1DM胰島炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷中發(fā)揮主導(dǎo)作用[9]。在T1DM患者和T1DM小鼠模型中均有miR-150表達(dá)降低的報(bào)道[10-12]。然而,miR-150與T1DM發(fā)生的相關(guān)機(jī)制目前尚不明確。本研究利用miR-150基因敲除小鼠并采用STZ誘導(dǎo)T1DM模型,探討miR-150缺失對(duì)T1DM發(fā)生的影響及其免疫學(xué)機(jī)制。

        有研究表明miR-150缺失促進(jìn)B1細(xì)胞分化和自身抗體產(chǎn)生?;加腥硇约t斑狼瘡和自身免疫性溶血性貧血等自身免疫性疾病的患者B淋巴細(xì)胞中miR-150表達(dá)降低[13,14]。本研究進(jìn)一步證實(shí)miR-150表達(dá)降低與T1DM相關(guān)的自身抗體產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)。然而,在本研究中,miR-150敲除小鼠并沒有發(fā)現(xiàn)自發(fā)糖尿病發(fā)生,只有經(jīng)STZ處理后較WT小鼠血糖上升顯著。以上結(jié)果表明,miR-150基因敲除小鼠體內(nèi)自身抗體的增加是T1DM的初始關(guān)鍵事件之一,但與糖尿病高血糖和疾病持續(xù)時(shí)間無關(guān)[15]。

        小鼠和人的研究表明CD4+Foxp3+Treg在抵抗T1DM中發(fā)揮重要作用,缺乏Treg的NOD小鼠加速T1DM發(fā)生,缺乏CD28的NOD小鼠在幼時(shí)就有較高的糖尿病發(fā)生率,而CD28是Treg發(fā)育的必需分子[16]。同樣,去除Treg發(fā)育或生存所必需的增殖信號(hào),如IL-2,會(huì)加重NOD小鼠的糖尿病[17]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明Treg下調(diào)可能參與STZ誘導(dǎo)的miR-150敲除小鼠T1DM的發(fā)生,但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

        大量研究顯示炎癥性T細(xì)胞浸潤(rùn)介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞破壞與T1DM的發(fā)生密切相關(guān)[18]。在人類中,CD8+T細(xì)胞主要浸潤(rùn)胰島,但其激活和增殖需要輔助性CD4+T細(xì)胞(Th)的幫助。其中,Th1介導(dǎo)的病理反應(yīng)被認(rèn)為是T1DM的重要因素,Th1細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子IFN-γ促進(jìn)T1DM發(fā)展。有研究表明人類胰島素啟動(dòng)子控制IFN-γ表達(dá),其可以促進(jìn)小鼠糖尿病的發(fā)生發(fā)展。相反,抑制IFN-γ在NOD小鼠的表達(dá)可以預(yù)防糖尿病[19-21]。另有研究表明,T1DM患者T細(xì)胞中IL-17增加,尤其是在疾病的早期階段。與年齡匹配的非糖尿病對(duì)照組相比,新發(fā)和長(zhǎng)期患T1DM的兒童IL-17陽性的T細(xì)胞更多[22,23]。此外,成年T1DM患者外周血CD4+T細(xì)胞中IL-17表達(dá)增加[24,25]。本研究發(fā)現(xiàn)STZ處理150KO小鼠與WT小鼠相比CD4+T和CD8+T細(xì)胞無明顯變化,但150KO小鼠中CD4+T細(xì)胞中IFN-γ和IL-17表達(dá)顯著上升。表明miR-150缺失不影響T細(xì)胞的數(shù)量變化,但可通過促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的分化加速糖尿病的發(fā)生。

        綜上,本研究發(fā)現(xiàn)miR-150缺失不影響STZ處理小鼠糖尿病相關(guān)自身抗體變化,但導(dǎo)致Treg減少,CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-17表達(dá)上升,說明miR-150缺失主要通過細(xì)胞免疫紊亂來加速T1DM的發(fā)生。另外,本研究結(jié)果提示miR-150的表達(dá)變化與T1DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此,一方面,miR-150表達(dá)水平有望成為T1DM病情發(fā)展或治療效果的有效預(yù)測(cè)指標(biāo);另一方面,通過基因工程方法或藥物提高機(jī)體免疫細(xì)胞特別是T細(xì)胞miR-150的表達(dá)也有望成為T1DM免疫治療的新策略。

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