高麗清 梁 靖 張 爽 李鈺銳 李潔心 劉 瀟 劉美麗 段一碩 趙亞林 張 琦 李曉曉 張 冰 王勇滿 李秋飛 鄭全輝

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北省慢性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，唐山市慢性病臨床基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,唐山 063210)

目前研究表明，Ⅰ型糖尿病(type Ⅰ diabetes mellitus,T1DM)是由于機(jī)體免疫自穩(wěn)功能失常導(dǎo)致的一類自身免疫性疾病，由抗體介導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答和效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答對胰島β細(xì)胞的攻擊是T1DM發(fā)病的重要原因[1,2]。microRNAs是一類具有負(fù)向基因表達(dá)調(diào)節(jié)功能的短鏈非編碼RNA(約22個(gè)核苷酸)，在機(jī)體多種免疫細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能發(fā)揮中具有重要調(diào)控作用[3]。miR-150在淋巴細(xì)胞中高表達(dá)。已有研究表明，miR-150在T1DM患者血清/血漿、外周血單個(gè)核細(xì)胞和胰島等組織中表達(dá)降低，提示miR-150在T1DM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而其作用機(jī)制目前尚未明確[4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-150缺失導(dǎo)致自然殺傷性T細(xì)胞IFN-γ產(chǎn)生增加，促進(jìn)小鼠T1DM的發(fā)生[5]。本研究采用鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)處理T1DM小鼠模型，進(jìn)一步研究了miR-150對T1DM相關(guān)自身抗體以及效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞的影響，以期為T1DM的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制研究提供新的線索。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 miR-150基因敲除(miR-150 knockout,150KO)和野生型正常對照(wild type,WT)的C57BL/6小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor,ME,USA)，并在華北理工大學(xué)SPF級鼠房飼養(yǎng)、繁殖。實(shí)驗(yàn)選取4～8周齡雄性150KO和WT小鼠，每組6～8只。小鼠實(shí)驗(yàn)操作按照華北理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會規(guī)定進(jìn)行。miR-150 敲除小鼠基因型鑒定采用下列引物:F：5′-CAAGGACAGGAACCCTTCAGCA-3′，R：5′-CCATGATGCCTGGAAGACATTTC-3′。miR-150KO小鼠和WT小鼠產(chǎn)物長度分別為262 bp和866 bp。

1.1.2主要試劑與儀器 STZ購自Sigma公司；胰島細(xì)胞自身抗體(ICA)和谷氨酸脫羧酶自身抗體(GADA)檢測ELISA試劑盒購自MultiSciences公司；熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD4(RM4-5)、抗CD8(53-6.7)、抗B220(RA3-6B2)、抗IL-4(11B11)、抗IFN-γ(XMG1.2)抗體購自美國BD公司；抗小鼠Foxp3(FJK-16s)抗體和細(xì)胞內(nèi)染色試劑盒購自美國eBiosciences公司；引物由上海生物工程服務(wù)公司合成；血糖儀購自瑞士羅氏公司。

1.2方法

1.2.1小鼠T1DM模型制備 STZ溶于0.1 mol/L pH4.5的檸檬酸緩沖液(Vehicle，Veh)，實(shí)驗(yàn)組選擇雄性野生型C57BL/6和miR-150KO小鼠，STZ 150 mg/kg 腹腔注射(WT+STZ;150KO+STZ)，對照組小鼠注射等量溶劑(WT+Veh；150KO+Veh)。注射當(dāng)天記為第0天，記錄小鼠血糖值，以后每隔3 d分別測量，連續(xù)記錄2周。血糖水平連續(xù)2次≥13.8 mmol/L(250 mg/dl)時(shí)診斷為糖尿病。

1.2.2小鼠基因型檢測 提取miR-150基因敲除小鼠(150KO)和野生型正常對照小鼠(WT)鼠尾DNA,PCR擴(kuò)增檢測其基因型。

1.2.3ELISA檢測小鼠ICA和GADA水平 STZ注射2周后，摘除眼球取血約1 ml至EP管，室溫自然凝固20 min，3 000 r/min離心20 min。加入樣品稀釋液40 μl以及樣品10 μl于相應(yīng)抗體包被板，37℃溫育30 min，棄去液體加入洗滌液洗板5次拍干。加入酶標(biāo)試劑50 μl，重復(fù)上述溫育，洗板，拍干。加入顯色劑37℃避光顯色15 min，450 nm處測量吸光度(OD)。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)分析 分別取STZ處理的150KO和WT小鼠脾臟，在含PBS的培養(yǎng)皿中研磨成單細(xì)胞懸液。4℃離心收集細(xì)胞并采用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，進(jìn)一步采用PBS離心、洗滌2次后重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，各組取1×106個(gè)細(xì)胞，首先加入Fc受體非特異性封閉抗體2.4G2于4℃封閉10 min，加入熒光素標(biāo)記抗體4℃染色30 min，PBS離心洗滌2次后上機(jī)檢測，采用FlowJo軟件進(jìn)行結(jié)果分析。對于Foxp3和細(xì)胞因子的細(xì)胞內(nèi)染色，收集培養(yǎng)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞表面染色后經(jīng)冷PBS洗滌，用新鮮配制的固定/打孔液重懸細(xì)胞，加入2.4G2 4℃封閉10 min，直接加入抗小鼠Foxp3、IFN-γ、IL-4和IL-17抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，4℃避光孵育30 min，固定，打孔液洗滌細(xì)胞2次后進(jìn)行流式分析。

2 結(jié)果

2.1小鼠基因型鑒定 結(jié)果如圖1所示，150KO小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長度為262 bp的DNA片段，WT小鼠擴(kuò)增產(chǎn)生長度為866 bp的DNA片段。

圖1 150KO和WT小鼠基因型Fig.1 Genotype of 150KO and WT mice

2.2miR-150缺失加速小鼠T1DM的發(fā)生 如圖2A所示，實(shí)驗(yàn)期間溶劑處理組WT和150KO小鼠平均血糖均為正常水平且差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STZ處理的WT小鼠的血糖水平從0～15 d緩慢升高，至STZ處理后第9天血糖水平明顯高于溶劑處理組。而150KO小鼠在STZ處理后僅3 d血糖水平顯著升高，且在隨后的3～15 d內(nèi)始終顯著高于STZ處理的WT小鼠(P<0.01)。與血糖水平變化一致。在STZ處理后3～15 d后，150KO小鼠的T1DM發(fā)生率明顯高于WT小鼠(圖2B)。

2.3STZ處理不增加150KO小鼠自身抗體水平 如圖3所示，與溶劑處理WT小鼠相比，溶劑處理150KO小鼠ICA和GADA水平均顯著升高 (P<0.01)。但STZ處理只提高WT小鼠ICA和GADA水平，對150KO小鼠ICA和GADA水平影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 miR-150缺失加速STZ誘導(dǎo)的T1DM發(fā)生Fig.2 miR-150 deletion accelerates onset of T1DM induced by STZNote:A.Compared with WT mice from day 3，**.P<0.01;B.Compared with WT+STZ,##.P<0.01.

圖3 STZ處理對150KO小鼠自身抗體水平的影響Fig.3 Effect of STZ treatment on levels of 150KO mice autoantibodiesNote:**.P<0.01.

2.4STZ處理的150KO小鼠Treg細(xì)胞顯著減少 如圖4所示，與WT小鼠相比， 150KO小鼠CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和B220+B細(xì)胞無顯著變化(P>0.05)，但Treg比率顯著降低(P<0.05)。

圖4 STZ處理150KO小鼠脾臟中Treg細(xì)胞顯著減少Fig.4 Decreased Treg in spleen of STZ-treated 150KO miceNote:A.Percentage of CD4+T cells,CD8+T cells and B220+B cells in spleen;B.Percentage of CD4+Foxp3+Tregs in spleen；*.P<0.05.

圖5 STZ處理的150KO小鼠CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-17表達(dá)顯著上調(diào)Fig.5 Significantly increased IFN-γ and IL-17 expression in CD4+T cells of STZ-treated 150KO miceNote:*.P<0.05.

2.5STZ處理的150KO小鼠CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-17表達(dá)顯著上升 如圖5所示，與WT小鼠CD4+T細(xì)胞相比，150KO小鼠IL-4陽性的CD4+T細(xì)胞比率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但I(xiàn)FN-γ和IL-17陽性的CD4+T細(xì)胞比率顯著上升(P<0.05)。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，由自身抗體和效應(yīng)性T細(xì)胞對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生的特異免疫應(yīng)答損傷在T1DM的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[6]。多種自身抗體如ICA、GADA和胰島素抗體(IAA)已被作為T1DM的診斷指標(biāo)廣泛應(yīng)用于臨床[7]。抗CD20抗體(利妥昔單抗)已被證明可通過剔除B細(xì)胞延緩非肥胖糖尿病(non-obesediaketic，NOD)小鼠和新發(fā)病患者T1DM進(jìn)展[8]。在細(xì)胞免疫應(yīng)答中，CD4+T細(xì)胞通過識別T1DM易感相關(guān)HLAⅡ類分子提呈的抗原肽，活化產(chǎn)生多種炎癥細(xì)胞因子，在T1DM胰島炎癥細(xì)胞浸潤和組織損傷中發(fā)揮主導(dǎo)作用[9]。在T1DM患者和T1DM小鼠模型中均有miR-150表達(dá)降低的報(bào)道[10-12]。然而，miR-150與T1DM發(fā)生的相關(guān)機(jī)制目前尚不明確。本研究利用miR-150基因敲除小鼠并采用STZ誘導(dǎo)T1DM模型,探討miR-150缺失對T1DM發(fā)生的影響及其免疫學(xué)機(jī)制。

有研究表明miR-150缺失促進(jìn)B1細(xì)胞分化和自身抗體產(chǎn)生?；加腥硇约t斑狼瘡和自身免疫性溶血性貧血等自身免疫性疾病的患者B淋巴細(xì)胞中miR-150表達(dá)降低[13,14]。本研究進(jìn)一步證實(shí)miR-150表達(dá)降低與T1DM相關(guān)的自身抗體產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)。然而，在本研究中，miR-150敲除小鼠并沒有發(fā)現(xiàn)自發(fā)糖尿病發(fā)生，只有經(jīng)STZ處理后較WT小鼠血糖上升顯著。以上結(jié)果表明，miR-150基因敲除小鼠體內(nèi)自身抗體的增加是T1DM的初始關(guān)鍵事件之一，但與糖尿病高血糖和疾病持續(xù)時(shí)間無關(guān)[15]。

小鼠和人的研究表明CD4+Foxp3+Treg在抵抗T1DM中發(fā)揮重要作用，缺乏Treg的NOD小鼠加速T1DM發(fā)生，缺乏CD28的NOD小鼠在幼時(shí)就有較高的糖尿病發(fā)生率，而CD28是Treg發(fā)育的必需分子[16]。同樣，去除Treg發(fā)育或生存所必需的增殖信號，如IL-2，會加重NOD小鼠的糖尿病[17]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明Treg下調(diào)可能參與STZ誘導(dǎo)的miR-150敲除小鼠T1DM的發(fā)生，但其機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

大量研究顯示炎癥性T細(xì)胞浸潤介導(dǎo)的胰島β細(xì)胞破壞與T1DM的發(fā)生密切相關(guān)[18]。在人類中，CD8+T細(xì)胞主要浸潤胰島，但其激活和增殖需要輔助性CD4+T細(xì)胞(Th)的幫助。其中，Th1介導(dǎo)的病理反應(yīng)被認(rèn)為是T1DM的重要因素，Th1細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子IFN-γ促進(jìn)T1DM發(fā)展。有研究表明人類胰島素啟動(dòng)子控制IFN-γ表達(dá)，其可以促進(jìn)小鼠糖尿病的發(fā)生發(fā)展。相反，抑制IFN-γ在NOD小鼠的表達(dá)可以預(yù)防糖尿病[19-21]。另有研究表明，T1DM患者T細(xì)胞中IL-17增加，尤其是在疾病的早期階段。與年齡匹配的非糖尿病對照組相比，新發(fā)和長期患T1DM的兒童IL-17陽性的T細(xì)胞更多[22,23]。此外，成年T1DM患者外周血CD4+T細(xì)胞中IL-17表達(dá)增加[24,25]。本研究發(fā)現(xiàn)STZ處理150KO小鼠與WT小鼠相比CD4+T和CD8+T細(xì)胞無明顯變化，但150KO小鼠中CD4+T細(xì)胞中IFN-γ和IL-17表達(dá)顯著上升。表明miR-150缺失不影響T細(xì)胞的數(shù)量變化，但可通過促進(jìn)Th1和Th17細(xì)胞的分化加速糖尿病的發(fā)生。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-150缺失不影響STZ處理小鼠糖尿病相關(guān)自身抗體變化，但導(dǎo)致Treg減少，CD4+T細(xì)胞IFN-γ和IL-17表達(dá)上升，說明miR-150缺失主要通過細(xì)胞免疫紊亂來加速T1DM的發(fā)生。另外，本研究結(jié)果提示miR-150的表達(dá)變化與T1DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，一方面，miR-150表達(dá)水平有望成為T1DM病情發(fā)展或治療效果的有效預(yù)測指標(biāo)；另一方面，通過基因工程方法或藥物提高機(jī)體免疫細(xì)胞特別是T細(xì)胞miR-150的表達(dá)也有望成為T1DM免疫治療的新策略。