呂夢(mèng)嬌 吳姍姍 姚 婷 陳小華 臧國(guó)慶

(上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院感染科,上海 200233)

T細(xì)胞是功能最復(fù)雜、數(shù)量最多的淋巴細(xì)胞，主要參與體內(nèi)細(xì)胞免疫，可通過細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic lymphocytes,CTLs)反應(yīng)直接殺傷靶細(xì)胞，也可通過分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞免疫[1]。T細(xì)胞免疫療法在抗感染、腫瘤治療方面具有重要作用，調(diào)節(jié)T細(xì)胞免疫可增強(qiáng)抗感染和抗腫瘤免疫，從而促進(jìn)其對(duì)病毒性和免疫性疾病的治療作用[2，3]。

Tapasin是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中HLA Ⅰ類分子裝配的重要蛋白，是主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ類抗原呈遞途徑的關(guān)鍵組成部分，參與T細(xì)胞免疫過程[4]。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells,DCs)是體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，通過共刺激分子和MHC分子識(shí)別和呈遞抗原至T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，阻斷DC相關(guān)通路可抑制T細(xì)胞免疫應(yīng)答[5-7]。

外泌體是核內(nèi)體與質(zhì)膜融合形成的納米級(jí)囊泡，能在細(xì)胞間傳遞信息物質(zhì)[8]。大部分細(xì)胞都能分泌外泌體，不同細(xì)胞分泌的外泌體既有其共性，如表達(dá)CD9、CD63等，也有其自身特性，如DCs來源外泌體表達(dá)MHC分子，有效激活T細(xì)胞，誘導(dǎo)抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，同時(shí)促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生[9，10]。IFN-γ是活化的T細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，可激活機(jī)體多種免疫細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。新近研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T細(xì)胞有利于HBV病毒的清除[11]。

本研究分離過表達(dá)Tapasin的小鼠骨髓來源DCs分泌的外泌體與T細(xì)胞在體外相互作用，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染病毒的DCs來源外泌體(Tap-Dexs)能促進(jìn)T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化，促進(jìn)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，有望在免疫相關(guān)疾病治療中發(fā)揮重要作用。

1 材料與方法

1.1材料 6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購(gòu)自上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物房；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)購(gòu)自Peprotech公司；CD11c(Ms CD11c BV421 N418 5 μg)購(gòu)自BD Pharmingen公司；無外泌體血清購(gòu)自SBI；RPMI1640購(gòu)自Hyclone；HSP90、CD9抗體購(gòu)自Abcam公司；CD3 Monoclonal Antibody、 CD28 Monoclonal Antibody、Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors，500X) 購(gòu)自eBioscience公司；絲裂霉素C購(gòu)自Sigma公司；IFN-γ和IL-2 ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；HBcAg(18-27)購(gòu)自上海吉爾公司。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓DCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 將C57BL/6小鼠脫頸處死取脛、股骨骨髓液于15 ml離心管，加入紅細(xì)胞裂解液靜置5 min后1 100 r/min離心5 min，PBS洗滌后用含血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸，加入GM-CSF(20 ng/ml)、IL-4(10 ng/ml)培養(yǎng)約3 d獲得DCs。收集上述細(xì)胞沉淀，用 50 μl經(jīng)過濾的PBS重懸，加入3 μl CD11c抗體，室溫避光孵育30 min，PBS洗3次,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)。

1.2.2構(gòu)建過表達(dá)Tapasin的病毒并轉(zhuǎn)染至DCs 從GenBank中查詢目的基因及其上下游序列，設(shè)計(jì)引物。根據(jù)分子克隆方法通過PCR擴(kuò)增獲得目的基因Tapasin，用限制性內(nèi)切酶對(duì)表達(dá)載體pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-MCS-3Flag進(jìn)行酶切，無縫克隆試劑盒將Tapasin構(gòu)建入表達(dá)載體，使用DH5α感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、鋪菌，使用小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒擴(kuò)增質(zhì)粒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Tapasin-3Flag，引物序列為CMV-F：5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′，并比對(duì)目的基因和Tapasin序列。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞獲得過表達(dá)Tapasin的病毒，并檢測(cè)病毒滴度為2.59×108。按照病毒手冊(cè)操作轉(zhuǎn)染至上述分離的DCs，轉(zhuǎn)染步驟：細(xì)胞以1×105個(gè)/孔鋪于96孔板，按照MOI=20加入相應(yīng)病毒，混勻，將96孔板密封，于平角離心機(jī)1 000 g 離心1 h后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，8 h 后換新鮮培養(yǎng)基，48、72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光，流式細(xì)胞術(shù)分析GFP熒光表達(dá)情況。

1.2.3DC來源外泌體的提取 用無外泌體血清加RPMI1640培養(yǎng)轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染Tapasin病毒的DCs 48 h 后收集細(xì)胞上清，300 g 離心10 min去除漂浮細(xì)胞，棄沉淀繼續(xù)2 000 g離心10 min去除死細(xì)胞和脫落囊泡，取上清10 000 g離心30 min去除細(xì)胞碎片、脫落囊泡和凋亡小體，繼續(xù)取上清140 000 g離心70 min使外泌體和污染的蛋白沉淀，棄上清，PBS重懸，140 000 g離心70 min去除污染蛋白，所得沉淀即為外泌體，即Tap-Dexs和Dexs。

1.2.4電鏡觀察成熟DC來源外泌體 10 μl PBS稀釋10 μl分離純化的外泌體，滴加于2 mm載樣銅網(wǎng)，室溫靜置1 min，用濾紙吸去多余液體，3%(W/V)磷鎢酸鈉溶液室溫復(fù)染1 min，雙蒸水清洗后晾干，透射電子顯微鏡觀察外泌體并拍照。

1.2.5納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis，NTA) 1 ml經(jīng)過濾的PBS重懸分離純化的外泌體沉淀， 緩慢加入Zetaview儀器進(jìn)行檢測(cè)，追蹤和分析每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)，分析顆粒的直徑和濃度并保存分析數(shù)據(jù)。

1.2.6Western blot檢測(cè)外泌體相關(guān)蛋白表達(dá) 取一定量分離純化外泌體加入RIPA裂解液裂解后提取外泌體總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入適當(dāng)比例上樣緩沖液于100℃煮沸10 min使蛋白變性。采用PAGE凝膠快速制備試劑盒分別配制6%和10%分離膠和濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，通過轉(zhuǎn)膜液將目的蛋白和內(nèi)參轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，加入兔抗鼠一抗(Flag 1∶1 000；CD9 1∶1 000；β-actin 1∶1 000)4℃搖床過夜，回收一抗，PBS洗滌3次，每次10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h，回收二抗，PBS洗滌3次，每次10 min，加入ECL液于化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中曝光顯影。

1.2.7T細(xì)胞的分離及培養(yǎng) C57BL/6小鼠脾臟研磨后加入淋巴細(xì)胞分離液，2 200 r/min離心20 min，吸取4層分層中的第2層白膜，PBS洗滌后重懸，滴入尼龍毛柱中于37℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱中垂直靜置1 h，收集流出液離心后重懸即為T淋巴細(xì)胞。加入CD3(0.5 μg/ml)包被6孔板4℃過夜，加入上述得到的T細(xì)胞懸液并加入CD28(0.5 ng/ml)激活T細(xì)胞，于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.8CCK8法檢測(cè)外泌體對(duì)T細(xì)胞增殖的影響 小鼠骨髓DC加HBcAg 10 μg/ml(作為抗原激活DCs使其發(fā)揮功能)于細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育 24 h，將上述激活的T細(xì)胞與DCs(鋪板前用25 μg/ml絲裂霉素C刺激30 min抑制DCs增殖)按照5∶1、10∶1、20∶1的比例鋪于96孔板，分別加入培養(yǎng)基、Dexs、Tap-Dexs培養(yǎng)12 h后加入10 μl CCK8試劑，2 h 后于酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下OD值，計(jì)算平均值。

1.2.9ELISA法檢測(cè)外泌體對(duì)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2的影響 按1.2.7的方法提取小鼠脾臟T細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組加入10 μg/ml Tap-Dexs,陽(yáng)性對(duì)照組加入10 μg/ml Dexs，加入培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組，共培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞上清，按照ELISA試劑盒說明書檢測(cè)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2水平，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果

2.1DC的培養(yǎng)、誘導(dǎo)和鑒定 第1天可見細(xì)胞小而圓，比較分散，第3天可見細(xì)胞聚集成團(tuán)(圖1A)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，CD11c表達(dá)率為42.07%(圖1B)，表明DCs誘導(dǎo)成功。

2.2過表達(dá)Tapasin病毒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染DCs 構(gòu)建病毒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Tapasin-3Flag(圖2A)，測(cè)序?qū)Ρ饶康幕蚝蚑apasin序列一致。將上述構(gòu)建病毒轉(zhuǎn)染至DCs，熒光顯微鏡下觀察熒光，可見綠色熒光(圖2B)，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示GFP表達(dá)率為86.99%,表明轉(zhuǎn)染成功(圖2C)。

圖1 DCs的顯微鏡觀察和鑒定(×10)Fig.1 Microscopic observation and identification of DCs(×10)

圖2 過表達(dá)Tapasin病毒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染至DCs的熒光及GFP表達(dá)情況

2.3DC來源外泌體的提取和鑒定 通過電鏡觀察外泌體的形態(tài)呈圓形或橢圓形，可見數(shù)個(gè)小囊泡即為外泌體(圖3A)， NTA粒徑分析外泌體大小為100～150 nm(圖3B)，Western blot檢測(cè)其蛋白Tapasin和CD9表達(dá)如圖3C。Dexs和Tap-Dexs在大小和形態(tài)上以及外泌體標(biāo)志物方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Tap-Dexs可表達(dá)Tapasin，而Dexs不表達(dá)Tapasin，表明Tapasin僅存在于Tap-Dexs中，提示Tapasin病毒轉(zhuǎn)染成功。

2.4DC來源外泌體對(duì)T細(xì)胞增殖的影響 結(jié)果表明Tap-Dexs促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力優(yōu)于Dexs(圖4，P<0.01)， 驗(yàn)證了Tapasin在 T 細(xì)胞方面的作用。

2.5DC來源外泌體對(duì)T淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2的影響 結(jié)果表明Tap-Dexs能促進(jìn)T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2，比Dexs的作用更強(qiáng)(圖5，P<0.05)，提示Tapasin能促進(jìn)T細(xì)胞向Th1方向分化。

圖3 Tap-Dexs和Dexs的鑒定Fig.3 Identifications of Tap-Dexs and Dexs

圖4 CCK8法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖情況Fig.4 T lymphocytes proliferation detected by CCK8Note:**.P<0.01.

圖5 ELISA檢測(cè)IFN-γ和IL-2表達(dá)水平Fig.5 Expression levels of IFN-γ and IL-2 detected by ELISANote:***.P<0.001 vs Medium.

3 討論

近年來，外泌體成為研究熱點(diǎn)，其通過傳遞細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)和核酸)或通過表面的受體與效應(yīng)細(xì)胞發(fā)生作用參與細(xì)胞間的信息傳遞[12]。通過改變母細(xì)胞狀態(tài)可改變外泌體的特性從而使外泌體向特定的方向發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)Tapasin能促進(jìn)抗原呈遞，增強(qiáng)CD8+CTLs對(duì)腫瘤免疫的識(shí)別和破壞作用，同時(shí)Tapasin表達(dá)的降低與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)[13]。Tapasin在T細(xì)胞免疫中起重要作用。本研究通過將Tapasin病毒轉(zhuǎn)染至DCs使其表達(dá)Tapasin，提取其分泌的外泌體，使外泌體表達(dá)Tapasin，驗(yàn)證其對(duì)T細(xì)胞分化的影響。富含AFP的DC來源外泌體在肝細(xì)胞癌小鼠體內(nèi)表達(dá)明顯上升，表達(dá)IFN-γ和IL-2的CD8+T細(xì)胞數(shù)量增加，改變小鼠的免疫微環(huán)境，增強(qiáng)小鼠免疫應(yīng)答，發(fā)揮抗腫瘤免疫作用[14]。免疫細(xì)胞如DC、巨噬細(xì)胞等來源的外泌體在免疫研究領(lǐng)域具有重要價(jià)值[15]。DC來源外泌體能進(jìn)入小鼠脾臟，被CD4+T細(xì)胞攝取，通過內(nèi)分泌機(jī)制激活T細(xì)胞，同時(shí)趨化因子和炎癥細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2表達(dá)上升，改善小鼠心臟功能[16]。課題組前期研究表明含Tapasin的肽段CTP-HBcAg18-27-Tapasin可通過JAK/STAT通路誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞向Th1分化[17]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在體外，小鼠骨髓DC來源外泌體能促進(jìn)T細(xì)胞增殖和Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2分泌，增強(qiáng)免疫應(yīng)答，在免疫性疾病的治療中具有重要意義，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證DC來源外泌體在小鼠體內(nèi)的作用以及外泌體促進(jìn)T細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)T細(xì)胞分化的機(jī)制。進(jìn)一步研究DC來源外泌體對(duì)T細(xì)胞功能的影響將有助于免疫相關(guān)性疾病的治療。