戴尅戎

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院骨科，上海 200011

非擴增性干細胞治療技術(shù)是通過非體外培養(yǎng)、非細胞增殖的方式，從組織或組織液中直接獲取干細胞，通過物理方式或依靠細胞本身的特性濃縮聚集干細胞（如離心、富集等），直接應用或與材料混合后回植患者體內(nèi)，進行細胞治療。該類技術(shù)具有耗時短、污染可能性小、倫理問題少等優(yōu)勢。其中，利用骨髓間充質(zhì)干細胞本身黏附特性的干細胞篩選-富集-復合循環(huán)系統(tǒng)[screen-enrich-combine（-biomaterials） circulating system，SECCS]作為一種非擴增性干細胞治療技術(shù)，已經(jīng)用于230 余例臨床的骨修復病例，療效滿意[1-4]。

自20 世紀下葉起，人體干細胞的研究和應用逐步成為熱點，干細胞多能性和無限增殖能力備受關(guān)注，特別是多能干細胞應用技術(shù)越來越多地受到相關(guān)科學家和臨床醫(yī)生的重視，被認為具有巨大的研究價值和應用潛力。干細胞可望治療多種疾病，在組織再生和延緩衰老方面將發(fā)揮重要作用，是一種可以改變現(xiàn)代治療模式的新型技術(shù)，可以帶來巨大的經(jīng)濟價值和社會貢獻。1999 年，Science 雜志將人類胚胎干細胞研究成果評為當年世界十大科技進展之首。但是，近20 年來，干細胞的應用研究發(fā)展并未加速。其中一個重要因素是倫理問題。胚胎干細胞等相關(guān)的核轉(zhuǎn)移技術(shù)涉及人源性祖細胞，受到廣泛質(zhì)疑甚至反對。相對而言，成體干細胞的應用獲得多數(shù)學者的認可。但這同時也存在一些難以回避的問題。傳統(tǒng)技術(shù)通過干細胞分離、培養(yǎng)、誘導，從而得到有效數(shù)量的干細胞，這通常需要在分離干細胞之后通過體外培養(yǎng)以擴增干細胞數(shù)量。但體外培養(yǎng)過程時間久、操作繁瑣，并且存在干細胞干性下降、污染等一系列問題。更重要的是，體外培養(yǎng)擴增往往需要使用動物血清，或受到不良的理化因素影響而出現(xiàn)非二倍體的細胞。因此，在應用上一直受到倫理學限制。

細胞治療實質(zhì)上是通過將某些特定細胞輸注患者體內(nèi)，通過歸巢效應，或直接植入特定區(qū)域，利用細胞特性形成組織、修復器官，以治療相關(guān)的臨床疾病。21 世紀以來，隨著人們對細胞研究的深入，細胞治療也不斷發(fā)展。目前，細胞治療已開始應用于不少臨床領(lǐng)域，如利用嵌合抗原受體T 細胞療法（chimeric antigen receptor T cell therapy，CAR-T）治療急性淋巴細胞白血病和淋巴瘤[5]，應用胰島細胞移植治療1 型糖尿病，應用角膜緣干細胞移植修復角膜，應用神經(jīng)干細胞移植治療腦外傷和帕金森病，應用骨髓間充質(zhì)干細胞促進骨軟骨再生修復長節(jié)段骨缺損，應用施萬（Schwann）細胞、神經(jīng)干細胞或祖細胞、嗅鞘細胞、少突膠質(zhì)細胞前體細胞或間充質(zhì)干細胞治療脊髓損傷[6]等。而人類多能干細胞的發(fā)現(xiàn)更是有望從根本上重塑再生醫(yī)學和人類對復雜疾病的研究，目前已開展多項有關(guān)人誘導多向潛能干細胞的相關(guān)臨床試驗[7]。

傳統(tǒng)干細胞治療技術(shù)包括樣本采集，干細胞分離、培養(yǎng)、移植等過程。而通過干細胞分離得到的干細胞數(shù)量往往較少，因此需要體外培養(yǎng)擴增以獲得足量細胞數(shù)。利用Ficoll 或Percoll 等分離液的密度梯度離心法，是實驗室常用的從骨髓血中分離骨髓單個核細胞（包含骨髓間充質(zhì)干細胞）的方法。研究人員應用該方法分離骨髓單個核細胞并用于臨床研究[8]。而為了得到足量的骨髓間充質(zhì)干細胞，則需進一步通過體外培養(yǎng)。這時除了上述細胞體外培養(yǎng)的常見問題外，密度梯度離心所需的分離液等相關(guān)試劑毒性，也成為干細胞治療過程中的阻礙。因此，如何規(guī)避這些繁瑣步驟，直接獲得足夠數(shù)量的干細胞用于臨床治療，成為細胞治療向前發(fā)展的重要挑戰(zhàn)之一，這也正是發(fā)展非擴增性干細胞治療技術(shù)的由來。

離心技術(shù)是細胞治療最常用的一種非擴增性方式。獲取的組織或組織液，通過離心濃縮富集獲得組織中的干細胞成分，但往往還混有一些其他細胞。如直接一起應用，有時也起到一定的相輔相成作用[2]。離心分離是最早期常用的非體外培養(yǎng)干細胞富集技術(shù)。離心技術(shù)包括差速離心和密度梯度離心。差速離心根據(jù)大小不同的細胞在同一介質(zhì)中沉降所需流速不同以分離不同的細胞。一般適用于分離大小懸殊的細胞。而密度梯度離心則是借助離心力作用形成一系列連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度不同的細胞分層，以達到分離細胞的目的；如COBE 2991（美國Gambro BCT公司）或Celution 系統(tǒng)（美國Cytori 公司）正是通過此原理實現(xiàn)對血液或脂肪組織液中干細胞的分離，而不需要體外培養(yǎng)[9]。但通過離心技術(shù)很難實現(xiàn)干細胞的精準 分離。

免疫磁珠分選技術(shù)是一種新興技術(shù)。免疫技術(shù)的發(fā)展也為非體外培養(yǎng)干細胞治療技術(shù)帶來了新思路。通過免疫磁珠標記具有特異性表面分子的細胞，如標記CD34或CD133 陽性的細胞，再通過磁場中磁力的作用，將標有免疫磁珠的細胞（陽性細胞）或未能標記的細胞（陰性細胞）篩選出來。CliniMACs 系統(tǒng)（德國Miltenyi 公司）就是利用該原理設(shè)計出的細胞分離裝置。目前已有相關(guān)臨床研究，通過該方法篩選干細胞治療心肌梗死[10-11]。CliniMACs 系統(tǒng)在歐洲一些國家也已用于臨床，但應用“陽性”選擇在分離外周血中造血干細胞時，CD34 細胞復原率較低，僅為60%。美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）輸血醫(yī)學部細胞加工實驗室使用抗AC133 的抗體來篩選造血干細胞，抗AC133 抗體選擇的造血干細胞與抗CD34 抗體選擇的細胞群仍存在部分差異，目前尚有許多問題處于研究階段[12]。

SECCS，或稱非擴增性干細胞富集技術(shù)，是利用干細胞的黏附特性，將骨髓血循環(huán)過濾于多孔生物材料上，達到篩選干細胞并富集-復合于生物材料，隨后回植體內(nèi)達到修復骨缺損的目的。目前，我們利用該方法已完成相關(guān)動物實驗及人體體外實驗[2-3]，隨即在上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院和上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院進行了相關(guān)人體體內(nèi)臨床研究[4,13-14]，通過對過濾前后細胞特性的分析發(fā)現(xiàn)，過濾富集過程并不會影響細胞的凋亡和增殖能力，具有良好的生物安全性。該技術(shù)已獲得10 余項國家專利，具有自主知識產(chǎn)權(quán)，可在手術(shù)同期完成骨髓干細胞采集-篩選-富集-復合生物材料的制備，干細胞數(shù)量足以滿足質(zhì)量需求，術(shù)中直接回植，無需體外培養(yǎng)。避免了體外長時間培養(yǎng)、易污染、使用異種血清及相關(guān)倫理學問題，臨床療效滿意。目前已應用治療230 多例骨不連、骨缺損、新鮮骨折骨缺損、股骨頭壞死、脊柱關(guān)節(jié)融合、距骨骨軟骨損傷、良性骨腫瘤切除后的骨修復等需要骨再生的患者[15-16]，結(jié)果提示該方法制備的生物活性材料，其骨修復結(jié)果不遜于“金標準”自體骨移植的骨修復療效，總體有效率達到95%。

展望干細胞研究與應用的發(fā)展，體外培養(yǎng)干細胞治療技術(shù)仍是干細胞治療的主要方式。非擴增干細胞治療技術(shù)所形成的理念是一種新興技術(shù)思路，目前采用這類技術(shù)進行臨床研究或臨床治療的報道數(shù)量還不多。而隨著對干細胞研究的深入，非體外培養(yǎng)干細胞治療技術(shù)憑借其獨特的優(yōu)勢必將在干細胞治療中獲得一席之地，成為干細胞治療的有效方式之一。非擴增干細胞治療技術(shù)直接或間接地通過增加干細胞分離過程中得到的干細胞數(shù)量，省去干細胞體外培養(yǎng)擴增的步驟，從而極大程度地降低干細胞治療技術(shù)的難度，提高了干細胞治療的安全性，規(guī)避了相關(guān)倫理學的問題，其應用范圍顯然不僅僅限于骨科。隨著細胞分離技術(shù)的發(fā)展，新興干細胞分離技術(shù)，如微流控技術(shù)、流式細胞術(shù)、吸附技術(shù)、過濾富集技術(shù)等，也將成為非體外培養(yǎng)干細胞治療技術(shù)的一部分，甚至可以實現(xiàn)細胞的精確分離和定量分離，根據(jù)疾病需要，針對性進行細胞治療，達到經(jīng)濟、有效的治療效果。

參·考·文·獻

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