王亞杰，周啟昕，周 佳，劉玥欣，王晉冀，徐 巖，黃曉巍

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院·吉林長(zhǎng)春·130117）

中藥柴胡具有解表退熱、升舉陽氣、疏肝解郁的功效。臨床廣泛應(yīng)用于感冒發(fā)燒，寒戰(zhàn)發(fā)熱、胸痛等?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，柴胡具有解熱、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、增強(qiáng)免疫力、抗抑郁及抗腫瘤等作用[1]。五柴胡飲始載于《景岳全書》：“柴胡1-3錢，當(dāng)歸2-3錢，熟地3錢，白術(shù)2錢，白芍半錢，炙甘草1錢，用于中氣不足，外邪不散；傷寒，瘧疾，痘瘡”?！秱鶗?、《先醒齋廣筆記》、《古今醫(yī)統(tǒng)大全》等古籍中記載：“和解藥先煎柴胡”[2-5]。通過前期化學(xué)研究，得到結(jié)論，柴胡煎煮35 min時(shí)，煎煮液中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量最高，依據(jù)國家中醫(yī)藥管理局2009年頒發(fā)的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》中解表類復(fù)方湯劑對(duì)煎煮時(shí)間的相關(guān)規(guī)定，柴胡煎煮35 min即柴胡先煎15 min[6]，通過觀察柴胡不同煎煮時(shí)間對(duì)五柴胡飲解熱、免疫作用影響，探討柴胡的特殊煎煮時(shí)間，并深入探討五柴胡飲的免疫作用與抑制TLRs/NF-κB信號(hào)通路表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

Wistar大鼠 140 只，雌雄各半，體質(zhì)量（220±20）g，由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)-2016-0003。

1.2 藥品與試劑

北柴胡飲片、熟地黃飲片、當(dāng)歸飲片、白術(shù)飲片：河北祁一堂藥業(yè)有限公司，批號(hào)1702107、1708074、1709066、1704046；白芍飲片、炙甘草飲片：安國市輝發(fā)中藥飲片加工有限公司，批號(hào)160101、160809；布洛芬片，山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字 H37022628， 批號(hào)：1807163；IL-4 ELISA kit、IL-10 ELISA kit、TNF-α ELISA kit 和 TLR-4ELISA kit，武漢酶免生物科技有限公司，貨號(hào)：MM-0191R1、MM-0195R1、MM-0180R1、MM-0221R1；IL-4一抗、IL-10一抗、TNF-α 一抗、TLR-4一抗、GAPDH一抗、HRP二抗，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：66142-1-Ig、60269-1-Ig、17590-1-AP、19811-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP）； 全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)試劑盒、彩虹245廣譜蛋白Marker、SDSPAGE凝膠制備試劑盒：北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：BC3711、PC0020、SW2010、PR1920、P1200-2。

1.3 儀器設(shè)備

煎藥壺 （廣東小熊電器有限公司，型號(hào)：YSHA15W6）；萬分之一分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，型號(hào)：ME204）；足趾容積測(cè)量?jī)x（成都泰盟科技有限公司，型號(hào)：PV-200）；電子溫度計(jì)（深圳美韻聲科技有限公司，型號(hào)：MS-8805）；高速冷凍離心機(jī)（德國 Eppendorf公司，型號(hào)：5424R）；酶標(biāo)儀（美國Thermo公司，型號(hào)：Multiskan FC）；電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：DY89-Ⅱ）；電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、電泳槽 （伯樂bio-rad，型號(hào)：BE6085）；凝膠成像儀（英國 UVItec 公司，型號(hào)：Alliance Q9）。

1.4 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠解熱作用的影響

1.4.1 動(dòng)物分組

Wistar大鼠 70 只，體重 180～220 g，雌雄各半，隨機(jī)分為7組，依次為：空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（洛芬布溶液 0.25 g·mL-1）、柴胡先煎 20、30、35、40 min組。

1.4.2 藥物制備

五柴胡飲的制備：稱取30g柴胡，加500mL水浸泡 30min，分別將柴胡先煎 0、10、15、20min 后加入已用500mL水浸泡30min的 20g當(dāng)歸、30g熟地、20g白術(shù)、5g白芍、10g炙甘草繼續(xù)煎煮20min，過濾藥渣后濃縮至含柴胡濃度為1 g·mL-1，放涼，備用。陽性藥的制備：布洛芬溶液的制備，取藥品粉末40.00 g，用水160 mL制成濃度為0.25 g·mL-1溶液備用。

1.4.3 給藥劑量與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行2天的適應(yīng)性飼養(yǎng)后，開始給予受試藥物。按10 mL·Kg-1劑量對(duì)各組大鼠灌胃給藥，模型對(duì)照組給予等體積的純凈水，連續(xù)給藥7d。

1.4.4 模型復(fù)制和指標(biāo)檢測(cè)

在大鼠給藥前，測(cè)量體溫作為基礎(chǔ)體溫，末次給藥1h后，根據(jù)各組大鼠體質(zhì)量10 mL·kg-1分別于皮下注射15%酵母混懸液，致發(fā)熱模型，分別于致熱后1、2.5、3、4、5、6、7、8 h 測(cè)量并記錄各組大鼠體溫。

1.5 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠免疫作用的影響

1.5.1 動(dòng)物分組

同“1.4.1”。

1.5.2 藥物制備

同“1.4.2”。

1.5.3 給藥劑量與方法

同“1.4.3”。

1.5.4 模型復(fù)制和指標(biāo)檢測(cè)

給藥前測(cè)量各組大鼠足趾體積，作為基礎(chǔ)數(shù)值，末次給藥1 h后，分別于各組大鼠足趾底部皮下注射蛋清液0.1 mL，致各組大鼠足趾急性發(fā)炎，分別于致炎后 0.5、1、2、3、4 h 時(shí)測(cè)量并記錄各組大鼠足趾體積，計(jì)算足趾腫脹率（足趾腫脹率=(體積-體積基礎(chǔ))/體積基礎(chǔ)*100%）。

1.6 臟器指數(shù)測(cè)定

將“1.5”項(xiàng)下各組大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血、處死，取血清、脾臟及胸腺，用濾紙吸干殘血后稱重。臟器指數(shù)=臟器濕重（g）/體重（g）*100%。

1.7 ELISA 檢測(cè)大鼠血清中 IL-4、IL-10、TNF 和TLR-4的水平

從-80℃超低溫冰箱取出血清，按武漢酶免生物科技有限公司提供的ELISA試劑盒說明書檢測(cè)各組大鼠血清中IL-4、IL-10、TNF和TLR-4的含量。

1.8 Westen blot檢測(cè)大鼠脾臟組織中IL-4、IL-10、TNF和TLR-4表達(dá)水平

取“1.5”項(xiàng)下各組大鼠脾臟0.1g，按北京索萊寶提供的全蛋白提取試劑盒說明書提取各組大鼠脾臟組織總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)樣品進(jìn)行蛋白定量，調(diào)節(jié)蛋白濃度為2 g·L-1；將蛋白樣品與等體積2×樣品緩沖液混合后，100℃水浴5 min后即刻放入冰浴中冷卻；將樣品加入到放置好SDS-PAGE膠的加樣孔內(nèi)，每孔加樣20μL，100V恒定電流轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出PVDF膜，采用TBST洗滌3次，每次5 min，之后將膜放入5%脫脂奶粉中，水平搖床，室溫下封閉1 h。封閉結(jié)束后，將膜取出，TBST浸洗3次，每次5 min，向洗膜盒中加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000）稀釋液，4℃儲(chǔ)存，過夜。加 HRP 標(biāo)記二抗（1:2 000），水平搖床，室溫封閉2 h。加入ECL發(fā)光液，室溫孵育膜1 min。將膜正面朝上放到凝膠成像儀內(nèi)，照相、記錄結(jié)果。對(duì)電泳條帶進(jìn)行灰度值掃描，對(duì)各目的蛋白進(jìn)行半定量分析。以目的條帶與GAPDH灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量[7]。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料均采用表示，多組均數(shù)組間比較采用t檢驗(yàn)分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠解熱作用的影響

各組大鼠皮下注射15%酵母混懸液后，均產(chǎn)生發(fā)熱現(xiàn)象。與空白對(duì)照組比較，模型組在注射15%酵母混懸液后 2.5、3、4、5、6、7、8 h 時(shí)，體溫明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、柴胡先煎 15min 組在注射 15%酵母混懸液后 2.5、3、4、5、6、7、8 h 時(shí)，體溫明顯降低（P＜0.05 或 P＜0.01）；柴胡先煎10min、20min組在造模后2.5、3、4 h時(shí)，體溫明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01）；柴胡先煎 0min組在造模后2.5、3、4 h 時(shí)，體溫明顯降低（P＜0.05），結(jié)果表明，柴胡先煎15 min，解熱效果最為顯著，持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，詳見表1。

表1 柴胡不同煎煮時(shí)間對(duì)五柴胡飲解熱作用的影響結(jié)果（n=10，±s）Table 1 Effect of Different Boiled Time of Bupleurum on Antipyretic Effect of Wuchaihu Drink（n=10，±s）

組別 1h體溫（℃） 2.5h體溫（℃） 3h體溫（℃） 4h體溫（℃）空白對(duì)照組 36.47±0.15 36.52±0.16 36.56±0.16 36.59±0.17模型組 36.23±0.19 36.82±0.30# 37.87±0.45# 38.73±0.59#陽性對(duì)照組 36.11±0.28 36.37±0.24△ 36.75±0.27△ 37.29±0.32△柴胡先煎0min組 36.19±0.27 36.50±0.12△△ 37.44±0.51△△ 38.11±0.52△△柴胡先煎10min組 36.14±0.26 36.44±0.17△ 37.28±0.69△△ 37.87±0.43△柴胡先煎15min組 36.12±0.35 36.41±0.17△ 36.96±0.41△ 37.54±0.36△柴胡先煎20min組 36.15±0.18 36.49±0.14△△ 37.32±0.59△△ 37.92±0.49△

續(xù)表1 柴胡不同煎煮時(shí)間對(duì)五柴胡飲解熱作用的影響結(jié)果（n=10，±s）Table 1 Effect of Different Boiled Time of Bupleurum on Antipyretic Effect of Wuchaihu Drink （n=10，±s）

續(xù)表1 柴胡不同煎煮時(shí)間對(duì)五柴胡飲解熱作用的影響結(jié)果（n=10，±s）Table 1 Effect of Different Boiled Time of Bupleurum on Antipyretic Effect of Wuchaihu Drink （n=10，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

組別 5h體溫（℃） 6h體溫（℃） 7h體溫（℃） 8h體溫（℃）空白對(duì)照組 36.65±0.17 36.69±0.23 36.64±0.18 36.61±0.14模型組 38.41±0.32# 38.09±0.40# 37.73±0.37# 37.28±0.43#陽性對(duì)照組 37.39±0.36△ 37.25±0.40△ 37.17±0.19△ 36.76±0.30△柴胡先煎 0min 組 38.27±0.18 37.85±0.34 37.63±0.32 37.23±0.29柴胡先煎 10min 組 38.02±0.39 37.69±0.27 37.45±0.25 37.01±0.34柴胡先煎15min組 37.70±0.38△ 37.46±0.39△△ 37.29±0.32△△ 36.93±0.35△△柴胡先煎 20min 組 38.07±0.32 37.72±0.33 37.51±0.28 37.06±0.44

2.2 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠免疫作用的影響

蛋清致大鼠足趾腫脹屬于異種蛋白的刺激引起的炎性反應(yīng)，一般持續(xù)4～6 h。本研究各組大鼠于足趾部皮下注射蛋清后，均產(chǎn)生足趾腫脹現(xiàn)象。與空白對(duì)照組比較，模型組在注射蛋清液后1、2、3、4 h時(shí)，足趾腫脹率明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組（布洛芬溶液）、柴胡先煎0、10、20 min組在注射蛋清液后 1、2、3、4 h 時(shí)，足趾腫脹率明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），柴胡先煎15 min組時(shí)對(duì)大鼠足趾腫脹的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.01），詳見表2。

表2 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠足趾腫脹的影響結(jié)果（n=10，±s）Table 2 Effect of different decoction time Bupleurum on Wuchaihu drink on toe swelling of rats（n=10，±s）

表2 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠足趾腫脹的影響結(jié)果（n=10，±s）Table 2 Effect of different decoction time Bupleurum on Wuchaihu drink on toe swelling of rats（n=10，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

組別 1h（%） 2h（%） 3h（%） 4h（%）空白對(duì)照組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 72.36±8.78# 59.18±5.35# 50.97±5.14# 40.77±6.85#陽性對(duì)照組 41.63±4.01△ 37.29±4.20△ 31.99±3.64△ 24.68±3.63△柴胡先煎0min組 61.21±4.43△△ 52.32±6.40△△ 48.05±4.53 38.81±2.74柴胡先煎10min組 54.94±6.51△ 48.56±6.54△△ 44.17±4.82△△ 32.76±2.12△△柴胡先煎15min組 44.16±4.02△ 38.82±4.64△ 33.69±2.80△ 27.51±2.34△柴胡先煎20min組 55.34±6.11△ 49.51±7.45△△ 44.74±5.35△△ 32.97±2.34△△

2.3 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠臟器指數(shù)的影響

胸腺和脾臟反映人體免疫功能的淋巴器官，當(dāng)收到炎性介質(zhì)刺激時(shí)，胸腺和脾臟會(huì)發(fā)生明顯的變化，產(chǎn)生相應(yīng)的免疫反應(yīng)，以代償性增大為主要表現(xiàn)。本研究觀察了各組動(dòng)物的臟器指數(shù)變化，結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組動(dòng)物脾臟指數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組、柴胡先煎10 min、15 min組大鼠脾臟指數(shù)顯著降低 （P＜0.05或 P＜0.01），說明柴胡先煎15 min時(shí)對(duì)大鼠的胸腺、脾臟腫大治療效果最顯著，詳見表3。

表3 各組動(dòng)物脾臟指數(shù)的比較（n=10，±s）Table 3 Comparison of animal spleen index in each group（n=10，±s）

表3 各組動(dòng)物脾臟指數(shù)的比較（n=10，±s）Table 3 Comparison of animal spleen index in each group（n=10，±s）

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

組別 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù)空白對(duì)照組 0.10±0.013 0.28±0.031模型組 0.18±0.025# 0.48±0.094#陽性對(duì)照組 0.12±0.017△ 0.33±0.045△柴胡先煎0min組 0.15±0.022△△ 0.43±0.055柴胡先煎10min組 0.15±0.024△△ 0.42±0.053△△柴胡先煎15min組 0.12±0.020△ 0.37±0.044△△柴胡先煎20min組 0.15±0.023△△ 0.42±0.062

2.4 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠血清中IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平的影響

ELISA法檢測(cè)表明，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4水平明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對(duì)照組、柴胡先煎10、15、20 min 組大鼠血清 IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平明顯降低（P＜0.01），柴胡先煎15 min大鼠的免疫作用最強(qiáng)，詳見表4。

2.5 不同煎煮時(shí)間柴胡對(duì)五柴胡飲對(duì)大鼠脾臟中免疫因子IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4水平的影響

Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠脾臟中IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，陽性對(duì)照組大鼠脾臟組織中IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4含量均有明顯降低（P＜0.01）；柴胡先煎 10 min、15min 時(shí)大鼠脾臟組織中IL-4、IL-10水平明顯降低 （P＜0.01），柴胡先煎 0、10、15、20 min 大鼠脾臟組織中TNF-α和TLR-4含量均有明顯降低 （P＜0.05或P＜0.01），詳見表5，圖1。

表4 各組大鼠血清中 IL-4、IL-10、TNF 和 TLR-4 水平（n=10，±s）Table 4 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in of rats in each group

表4 各組大鼠血清中 IL-4、IL-10、TNF 和 TLR-4 水平（n=10，±s）Table 4 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in of rats in each group

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

組別 IL-4（ng/L） IL-10（ng/L） TNF-α（ng/L） TLR-4（ng/mL）空白對(duì)照組 186.08±14.73 78.64±5.30 101.13±4.26 1.26±0.14模型組 243.34±18.81# 101.92±4.68# 129.56±5.90# 30.23±3.24#陽性對(duì)照組 199.20±13.82△ 82.63±4.24△ 105.87±7.30△ 12.81±1.83△柴胡先煎 0min 組 226.14±22.62 97.31±4.69 125.77±6.74 24.19±2.08 △柴胡先煎10min組 214.57±18.61△ 92.63±4.03△ 114.28±5.75△ 21.33±2.62△柴胡先煎15min組 207.53±17.21△ 87.69±3.89△ 111.15±4.39△ 16.01±1.75△柴胡先煎20min組 218.97±11.97△ 94.93±2.64△ 119.33±4.68△ 22.53±2.45△

表5 各組大鼠脾臟中 IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平（n=3,±s）Table 5 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in spleen of rats in each group

表5 各組大鼠脾臟中 IL-4、IL-10、TNF-α 和 TLR-4水平（n=3,±s）Table 5 Expression levels of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 in spleen of rats in each group

注：與空白對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型組比較，△ P＜0.01，△△ P＜0.05。

組別 IL-4 IL-10 TNF-α TLR-4空白對(duì)照組 0.50±0.054 0.21±0.015 0.68±0.022 0.041±0.0052模型組 0.72±0.047# 0.47±0.040# 1.11±0.15# 0.54±0.039#陽性對(duì)照組 0.044±0.0084△ 0.32±0.022△ 0.07±0.003△ 0.30±0.027△柴胡先煎0min組 0.79±0.060 0.52±0.015 0.65±0.042△ 0.50±0.028△△柴胡先煎10min組 0.30±0.030△ 0.41±0.035△ 0.41±0.055△ 0.35±0.033△柴胡先煎15min組 0.21±0.030△ 0.38±0.039△ 0.32±0.026△ 0.33±0.034△柴胡先煎20min組 0.55±0.033△ 0.43±0.031△△ 0.66±0.074△ 0.39±0.056△

圖1 各組大鼠脾臟組織中IL-4、IL-10、TNF-α和TLR-4表達(dá)電泳圖Figure 1 Electrophoresis of IL-4,IL-10,TNF-αand TLR-4 expression in spleen of rats in each group

3 討論

柴胡是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中解表藥的代表藥物，具有疏散退熱、疏肝解郁、升陽舉氣等功效[6]。前期研究結(jié)果表明，柴胡在煎煮35 min時(shí)有效成分溶出率最高，而解表類中藥的煎煮時(shí)間一般規(guī)定為20 min，故柴胡應(yīng)以先煎15 min為宜。本次研究依據(jù)前期研究結(jié)果，制定實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，致痛動(dòng)物模型主要包括熱刺激和化學(xué)刺激兩種。本研究采用熱板法復(fù)制大鼠疼痛模型，具有造模時(shí)間短，結(jié)果明顯，可多次檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[8-10]。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，感冒疏風(fēng)片組、陽性對(duì)照組、柴胡先煎15min組大鼠的痛閾時(shí)間存在顯著性差異，柴胡先煎15min的五柴胡飲溶液可將大鼠的痛閾時(shí)間自22 s延長(zhǎng)至37 s，鎮(zhèn)痛效果顯著。

復(fù)制非特異性炎癥動(dòng)物模型主要依據(jù)炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程，采用冰醋酸、組胺、二甲苯等化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行模型復(fù)制[11]。本研究采用蛋清進(jìn)行大鼠足腫脹的動(dòng)物模型復(fù)制，操作難度低，使用排水法進(jìn)行數(shù)據(jù)監(jiān)測(cè)可反復(fù)多次測(cè)量，減小誤差[12]。本研究結(jié)果表明，MG造模1h后產(chǎn)生明顯的足趾部腫脹，與空白組差異明顯，模型可持續(xù)4～6h，各給藥組動(dòng)物足趾腫脹率均有不同程度下降，柴胡先煎15min組差異最顯著。脾臟和胸腺是人體免疫系統(tǒng)的重要器官，臟器系數(shù)常被用來評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，免疫缺陷模型大鼠脾臟和胸腺系數(shù)明顯升高，代表機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，免疫器官會(huì)發(fā)生代償性增大或水腫。五柴胡飲可明顯降低模型大鼠的脾臟和胸腺系數(shù)，提高機(jī)體的免疫功能。結(jié)果表明，柴胡先煎15 min時(shí)的五柴胡飲煎煮液對(duì)大鼠的胸腺、脾臟腫大治療效果最顯著。

TLRS/NF-κB信號(hào)通路的相關(guān)表達(dá)與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)息息相關(guān)，TLRS/NF-κB信號(hào)通路上的蛋白因子不僅參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外的正、負(fù)反饋調(diào)節(jié)，還參與淋巴細(xì)胞的合成，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子[13]。白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）、TNF-α、TOLL樣受體-4（TLR-4）均是該通路上重要的信號(hào)分子，這些信號(hào)因子的蛋白表達(dá)對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)存在一定影響。IL-4是T細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，通過與B細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合，活化抗原表達(dá)，促進(jìn)B細(xì)胞增殖[14]。IL-4大量產(chǎn)生后對(duì)其生成的前體物質(zhì)具有一定的決定作用，外源性IL-4可以誘導(dǎo)Th2細(xì)胞分化為Th2效應(yīng)細(xì)胞，繼而大量分泌IL-4、IL-13等細(xì)胞因子，引起機(jī)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)、哮喘等[15]。研究表明，IL-4可以抑制 IκB激酶 （IKK）、髓樣分化因子（MyD88）的活性，進(jìn)而抑制TLRS/NF-κB信號(hào)通路的活化活化[16]。IL-10是一種由CD4+T、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、Thl、Th2細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生，具有抑制炎性介質(zhì)釋放，產(chǎn)生免疫抑制的作用[17]。IL-10抑制單核巨噬細(xì)胞的生成，降低其抗原呈遞作用，通過抑制NF-κB對(duì)DNA的結(jié)合活性及抑制IκB激酶的活性來抑制NF-κB的激活[18]。TNF-α是一種由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與細(xì)胞的損傷、拮抗病毒活性、促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、激活核轉(zhuǎn)錄因子生物活性的蛋白質(zhì)，通過促進(jìn) IL-1、IL-2、IL-6、IL-8 等免疫因子的產(chǎn)生，參與全身免疫反應(yīng)[19]。TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-1和GM-CSF等炎性因子，導(dǎo)致炎癥的發(fā)生和發(fā)展，通過激活一氧化氮合酶(iNOS)，促進(jìn)NO合成，進(jìn)而刺激單核細(xì)胞釋放IL-8，使炎癥反應(yīng)加重[20]。TLR-4是一種廣泛分布于免疫細(xì)胞、心肌細(xì)胞和呼吸道上皮細(xì)胞以及絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞的跨膜蛋白，具有促進(jìn)T細(xì)胞和肝濾泡輔助性細(xì)胞的繁殖和分化，促進(jìn)炎癥因子干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）合成和分泌的功能[21]。研究表明TLR-4通過活化NF-κB信號(hào)通路，介導(dǎo)IL-1、IL-6、TNF-α炎性因子大量釋放，而加重組織損傷，通過來上調(diào)炎性因子COX-2和提高前列腺素E2、金屬蛋白酶的表達(dá)[22]。研究結(jié)果表明，柴胡先煎15min的五柴胡飲溶液，可以顯著降低模型大鼠的血清、脾臟TNF-α水平，抑制模型大鼠的炎癥反應(yīng)。TLR-4是TLRS家族表達(dá)最廣泛的免疫因子，其表達(dá)水平的提高可以激活TLRS/NF-κB信號(hào)通路，減弱機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)炎性細(xì)胞的監(jiān)視和殺滅作用。研究結(jié)果表明，柴胡先煎15min的五柴胡飲溶液，可以顯著降低模型大鼠的血清、脾臟TLR-4水平，抑制模型大鼠的炎癥反應(yīng)。