李麗靜，周凱旋，薛嘉寶，劉 佳，關(guān)婉辰，石美玲，王月潔，馬曉彤，宋嘉昱，鮑慧瑋

（長春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林長春·130117）

人參果為五加科植物人參 （Panax.ginseng C.A.Mey）的成熟果實[1]，含有人參皂苷、多糖、生物堿、揮發(fā)油、氨基酸等，其中主要化學(xué)成分是人參皂苷，包括人參皂苷 Re、Rg2、Rb1、Rb2、Rd 等[2-5]。 人參果皂苷在心腦血管疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)及抗腫瘤方面的作用顯著[6-8]。參麥注射液在臨床上常用于心血管類疾病的治療，對心血管系統(tǒng)具有良好的保護(hù)作用[9-10]。本研究通過對人參果提取物對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮HUVEC細(xì)胞的研究，以參麥注射液作為陽性對照藥，初步探討其保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的作用機制。

1 材料

1.1 儀器

酶標(biāo)儀 （Bio Tek）；IX73熒光倒置顯微鏡（Olympus）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher）；超凈工作臺（Thermo Fisher）。

1.2 藥品與試劑

人參果總皂苷（GFS）由課題組提取制備；參麥注射液（購于神威藥業(yè)）；CCK8試劑（購于同仁化學(xué)研究所）；MDC粉末 （購于sigma）；PBS緩沖液 （購于hyclone）；厭氧罐及厭氧袋 （購于三菱 MGC）；SOD、MDA、LDH試劑盒（購于南京建成生物工程研究所）。

1.3 細(xì)胞株及培養(yǎng)液

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及完全培養(yǎng)液，購自澳賽爾斯生物技術(shù)（上海）有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞分組與造模

HUVEC細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)液培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。HUVEC細(xì)胞分成正常組（正常培養(yǎng)）、模型組（缺氧復(fù)氧處理）、參麥注射液組（0.4mg/mL參麥注射液+缺氧復(fù)氧處理）、人參果總皂苷（GFS）低、中、高劑量組（25.5、50、100μg/mL 人參果總皂苷+缺氧復(fù)氧處理）。缺氧復(fù)氧造模，除正常組，其余組放入?yún)捬豕拗羞M(jìn)行缺氧處理，24h后，打開厭氧罐，進(jìn)行復(fù)氧4h處理。

2.2 人參果總皂苷對缺氧復(fù)氧HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用

對數(shù)生長期HUVEC調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/mL，接至96孔板，每孔100μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h棄培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔，按給藥分組處理細(xì)胞后，CCK8法測吸光度（OD值）。

2.3 人參果總皂苷對缺氧復(fù)氧HUVEC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

對數(shù)生長期HUVEC調(diào)整細(xì)胞密度至2×105/mL，接至24孔板，每孔500μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h棄培養(yǎng)基，每組設(shè)置3個復(fù)孔，按給藥分組處理細(xì)胞后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

2.4 人參果總皂苷對缺氧復(fù)氧HUVEC細(xì)胞自噬的影響

采用MDC法染色。接種于24孔板內(nèi)的細(xì)胞，給藥結(jié)束后PBS洗2次，洗去藥物，每孔加入MDC染色工作液300μL，于37℃、5%CO2條件下避光孵育20 min，然后各孔加入PBS 400μL清洗2次后，置于熒光倒置顯微鏡下，觀察MDC染色情況。

2.5 人參果總皂苷對缺氧復(fù)氧HUVEC細(xì)胞SOD、MDA、LDH水平的影響

分組給藥同“2.1”項下方法。按試劑盒給定方法檢測細(xì)胞上清液中LDH的含量與細(xì)胞中SOD、MDA的含量。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，單因素方差分析進(jìn)行組間均勻比較。

4 實驗結(jié)果

4.1 人參果總皂苷對HUVEC細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的保護(hù)作用

與正常組相比，模型組的吸光度降低，細(xì)胞存活率下降明顯（P＜0.01），給予參麥注射液組和人參果總皂苷后吸光度升高，細(xì)胞存活率顯著增高（P＜0.05），詳見表1。

表1 人參果總皂苷對胞缺氧復(fù)氧HUVECs存活的影響（±s，n=5）

表1 人參果總皂苷對胞缺氧復(fù)氧HUVECs存活的影響（±s，n=5）

注：相比于模型組 *P＜0.05,**P＜0.01

組別 CCK8吸光度正常組 1.12±0.11**模型組 0.57±0.13參麥注射液組 0.72±0.23*GFS低劑量組 0.68±0.25*GFS中劑量組 0.75±0.19*GFS高劑量組 0.82±0.09*

4.2 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察

造模后細(xì)胞皺縮、壞死、細(xì)胞核消失，視野中有漂浮的死細(xì)胞，給予參麥注射液及人參果總皂苷后，細(xì)胞形態(tài)明顯改善，細(xì)胞死亡數(shù)量減少。詳見圖1。

圖1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察

4.3 人參果總皂苷對HUVEC細(xì)胞缺氧復(fù)氧細(xì)胞自噬的影響

如圖2所示，缺氧復(fù)氧造模后MDC染色熒光強度明顯增高，給藥后各組熒光強度有所下降，說明參麥注射液及人參果總皂苷各劑量組對缺氧復(fù)氧損傷的HUVEC細(xì)胞自噬具有抑制作用。

圖2 人參果總皂苷對HUVEC細(xì)胞缺氧復(fù)氧細(xì)胞自噬的影響

4.4 各組細(xì)胞SOD、MDA、LDH水平的檢測

與正常對照組比較，模型組細(xì)胞中SOD含量減少，MDA含量上升，培養(yǎng)液中LDH含量增高（P＜0.01），各給藥組細(xì)胞SOD含量增加，MDA含量降低，培養(yǎng)液中LDH 含量降低（P＜0.05 或 P＜0.01），詳見表2。

表2 各組細(xì)胞SOD、MDA、LDH水平的影響（±s，n=3）

表2 各組細(xì)胞SOD、MDA、LDH水平的影響（±s，n=3）

注：相比于模型組，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 SOD（U·mg prot-1） MDA（nmol·mg prot-1） LDH（U·L-1）正常組 41.65±1.24** 1.69±1.21** 197.42±28.78**模型組 18.22±2.69 5.30±2.22 552.79±47.15參麥注射液組 27.92±3.11* 3.34±2.07* 388.54±31.69*GFS 低劑量組 24.29±2.65* 4.98±2.87 510.13±42.13 GFS 中劑量組 26.98±3.13* 4.33±2.75* 476.23±28.67*GFS 高劑量組 29.56±3.28** 3.55±2.26** 419.77±29.73*

5 討論

血管內(nèi)皮細(xì)胞是組織與血液間的第一道屏障，是最先感受缺氧的細(xì)胞之一[11]，缺氧復(fù)氧損傷時產(chǎn)生的大量自由基可對內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)、功能造成損傷[12]，在心血管疾病中，如動脈粥樣硬化，病變中斑塊增厚及泡沫細(xì)胞耗氧量增加，易導(dǎo)致局部缺氧情況的產(chǎn)生[13]，心肌在供氧供血不足的情況下,易發(fā)生心肌梗死和猝死[14]。

人參果為五加科植物人參得干燥成熟果實，文獻(xiàn)報道含有多種人參皂苷，對心血管系統(tǒng)具有良好的作用，本實驗通過缺氧復(fù)氧造成HUVEC細(xì)胞損傷，模擬疾病狀態(tài)下血管內(nèi)皮細(xì)胞的氧化應(yīng)激環(huán)境，來研究人參果總皂苷對血管內(nèi)皮的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)人參果總皂苷對細(xì)胞存活具有促進(jìn)作用，氧化應(yīng)激在內(nèi)皮細(xì)胞代謝過程中，可以調(diào)節(jié)自噬，以清除過程中產(chǎn)生的不可逆、氧化的生物分子，維持損傷和去損傷之間的平衡[15]，人參果總皂苷可通過提高細(xì)胞對缺氧的耐受能力，從而對自噬具有一定降低作用，SOD、MDA、LDH均與細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)[16-17]，實驗結(jié)果顯示，人參果總皂苷對SOD、MDA、LDH的調(diào)節(jié)能力呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。綜上所述，人參果總皂苷可能通過提高細(xì)胞抗氧化能力，降低自噬水平，對心血管疾病所導(dǎo)致的缺氧損傷發(fā)揮保護(hù)作用。