張蓓蓓，朱秋鋼，芮棵，王勝軍，田潔

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001)

髓源性抑制細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)是一群具有免疫抑制能力、未成熟的異質(zhì)性髓系細(xì)胞[1]。MDSCs可分為兩個亞群，多核細(xì)胞樣MDSCs(PMN-MDSCs)和單核細(xì)胞樣MDSCs(M-MDSCs)。在小鼠中，MDSCs兩個亞群均高表達(dá)CD11b和Gr-1，Gr-1包含Ly-6G和Ly-6C兩個抗原表位，PMN-MDSCs表型為CD11b+Ly-6G+Ly-6Clow，而M-MDSCs的表型則為CD11b+Ly-6G-Ly-6Chigh。研究表明，荷瘤小鼠和腫瘤患者體內(nèi)存在大量MDSCs的浸潤[2]。MDSCs在腫瘤免疫微環(huán)境中大量擴(kuò)增，并參與腫瘤的病理過程[3]。一方面，腫瘤免疫微環(huán)境通過分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子、IL-6等細(xì)胞因子，促進(jìn)MDSCs的增殖與功能；另一方面，MDSCs通過合成免疫抑制性效應(yīng)分子如精氨酸酶-1(Arg-1)、活性氧和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[4]。MDSCs的免疫抑制功能受多組信號的調(diào)控，包括JAK/STAT、PI3K/AKT等信號通路[5]。

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)配體(glucocorticoid induced TNF receptor ligand,GITRL)是腫瘤壞死因子超家族成員，主要高表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的表面，其受體GITR則高表達(dá)于活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞[6]。在腫瘤中，GITRL可作為共刺激分子，促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的活化，并抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，促進(jìn)機(jī)體正向免疫應(yīng)答，因此，GITRL可有效增強(qiáng)機(jī)體抗瘤免疫應(yīng)答[7-8]。GITRL是否通過調(diào)控MDSCs的免疫抑制功能進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體抗瘤免疫應(yīng)答尚需進(jìn)一步研究。本研究利用GITRL蛋白刺激Lewis肺癌移植瘤小鼠來源的MDSCs，檢測GITRL處理后的MDSCs對野生型小鼠來源的CD4+T細(xì)胞增殖的影響以及胞內(nèi)相關(guān)免疫抑制效應(yīng)分子的表達(dá)，觀察GITRL對腫瘤來源的MDSCs免疫抑制功能的調(diào)控作用，并探究其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

8～10周齡SPF 級雄性C57BL/6小鼠，質(zhì)量(24±2)g，購于江蘇大學(xué)動物中心(合格證編號:NO.201905095)。小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株購于上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

DMEM，1640培養(yǎng)液，小牛血清，胎牛血清(以色列BI公司)；抗生物素磁珠，小鼠CD4+T細(xì)胞分選試劑盒(德國美天旎公司)；生物素標(biāo)記的抗小鼠CD11b抗體，PE/Cy5標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD11b抗體，PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠Gr-1抗體，F(xiàn)ITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠GITR抗體，PE/Cy5標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4抗體(美國BioLegend公司)；哺乳動物蛋白提取液(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；精氨酸酶檢測試劑盒(美國BioAssay systems公司)；一氧化氮檢測試劑盒(美國Promega公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗小鼠p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3、β-肌動蛋白抗體，HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.2 構(gòu)建小鼠Lewis肺癌移植瘤模型

培養(yǎng)Lewis肺癌細(xì)胞至對數(shù)生長期，將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶中消化下來，并重懸于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，細(xì)胞濃度為1×107/mL。于C57BL/6小鼠右側(cè)背部皮下注射0.1 mL Lewis肺癌細(xì)胞懸液，即每只小鼠注射1×106Lewis肺癌細(xì)胞。

1.3 磁珠分選MDSCs

處死Lewis肺癌移植瘤小鼠，取脾臟研磨成細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，加入生物素標(biāo)記的抗小鼠CD11b抗體(10 μL/108細(xì)胞)，彈勻后置于冰上孵育30 min；洗去多余抗體，加入抗生物素磁珠(12 μL/108細(xì)胞)，置于冰上孵育30 min；洗去多余抗體，將細(xì)胞重懸于500 μL PBS-EDTA緩沖液中，將其加入分選柱中，再加入PBS-EDTA，待分選柱中的液體流盡后，向柱中加入5 mL PBS-EDTA，用推柱將液體從柱中用力推出，收集細(xì)胞。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs的純度及表面GITR的表達(dá)

取1×106個MDSCs，重懸于100 μL PBS，加入PE/Cy5標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD11b抗體、PE標(biāo)記的大鼠抗小鼠Gr-1抗體和FITC標(biāo)記的大鼠抗小鼠GITR抗體(或同型對照抗體)，于4℃孵育30 min。加入PBS洗滌，4℃、500 ×g離心5 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面Gr-1、CD11b、GITR的表達(dá)。

1.5 磁珠分選CD4+ T細(xì)胞

取野生型C57BL/6小鼠脾臟，研磨成細(xì)胞懸液，裂解紅細(xì)胞后，加入抗小鼠CD4磁珠(10 μL/108細(xì)胞)，彈勻后置于冰上孵育30 min；PBS-EDTA洗去多余抗體，將細(xì)胞重懸于500 μL PBS-EDTA中，將其加入分選柱中，再加入PBS-EDTA，待分選柱中的液體流盡后，向柱中加入5 mL PBS-EDTA，用推柱將液體從柱中用力推出，收集細(xì)胞。

1.6 MDSCs對CD4+ T細(xì)胞增殖的抑制試驗(yàn)

取96孔U形底培養(yǎng)板，向孔中加入50 μL碳酸鹽包被液和0.5 μL抗小鼠CD3單克隆抗體(1 μg/μL)，4℃孵育過夜，洗去游離的抗體。將CD4+T細(xì)胞重懸于1 mL PBS中，加入羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)染料，終濃度為5 μmol/mL，于37℃水浴鍋中避光孵育10 min。立即向試管中加入5 mL預(yù)冷的1640培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)終止反應(yīng)。用1640培養(yǎng)液(含10% 胎牛血清)洗滌3次。收集GITRL(5 μg/mL)處理48 h后的MDSCs，將MDSCs和CD4+T細(xì)胞按1 ∶1的比例種入96孔培養(yǎng)板中，每孔共5×105個細(xì)胞。陽性對照孔中加入5×105個CD4+T細(xì)胞。每孔加入0.5 μL抗小鼠CD28單克隆抗體(1 μg/μL)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中，避光孵育72 h。收集細(xì)胞，加入PE/Cy5標(biāo)記的大鼠抗小鼠CD4抗體，于4℃孵育30 min。加入PBS洗滌，4℃、500×g離心5 min，用流式細(xì)胞儀檢測CD4+T細(xì)胞的增殖情況。

1.7 比色法檢測MDSCs胞內(nèi)Arg-1的活性

收集GITRL(5 μg/mL)處理48 h后的MDSCs，加入哺乳動物蛋白提取液提取蛋白。配置底物緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)品、顯色液，分別將標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本加入檢測孔中，并設(shè)置空白對照孔，每孔加入10 μL底物緩沖液，將檢測板放入水浴鍋中，37℃避光孵育2 h。每孔加入200 μL顯色液，室溫避光孵育10 min。用酶標(biāo)儀讀取520 nm波長處的光密度值，計(jì)算酶活性。

1.8 Griess偶聯(lián)法檢測MDSCs一氧化氮釋放量

GITRL(5 μg/mL)處理MDSCs 48 h后，收集培養(yǎng)上清液。將標(biāo)準(zhǔn)品和待測上清液分別加入檢測孔中，每孔50 μL，再加入50 μL對氨基苯磺酰胺緩沖液，室溫避光孵育5 min，加入50 μL顯色液，室溫避光孵育5 min。用酶標(biāo)儀讀取520 nm波長處的光密度值，計(jì)算待測樣本一氧化氮的含量。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法檢測MDSCs胞內(nèi)信號分子

將MDSCs接種于24孔培養(yǎng)板中，使每孔1×106個細(xì)胞，加入5 μg/mL GITRL蛋白，分別于0、30、60 min后收集細(xì)胞，加入哺乳動物蛋白提取液提取蛋白。配制10% SDS-PAGE凝膠，加入適量蛋白樣本進(jìn)行電泳，以350 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜置于5%牛血清白蛋白中室溫封閉1 h。分別加入兔抗小鼠p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3(1 ∶1 000)和β-肌動蛋白抗體(1 ∶5 000)，4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗滌后，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1 ∶5 000)室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌后曝光。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Lewis荷瘤小鼠脾臟MDSCs表達(dá)GITR

通過流式細(xì)胞術(shù)檢測MDSCs的純度，磁珠分選后CD11b+Gr-1+細(xì)胞達(dá)90%以上，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示荷瘤小鼠來源的MDSCs表面表達(dá)GITR。見圖1。結(jié)果說明Lewis荷瘤小鼠脾臟浸潤的MDSCs表達(dá)GITR。

圖1 荷瘤小鼠脾臟MDSCs分選純度及表面GITR的表達(dá)

2.2 GITRL抑制荷瘤小鼠脾臟MDSCs的免疫抑制功能

GITRL蛋白(5 μg/mL)刺激MDSCs 48 h后，與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)72 h。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，GITRL處理組的MDSCs對CD4+T細(xì)胞增殖的抑制能力明顯減弱。此外，GITRL處理組MDSCs的Arg-1活性明顯降低(t=4.208,P<0.05)，一氧化氮釋放量明顯減少(t=5.355,P<0.01)。見圖2。結(jié)果說明GITRL可抑制荷瘤小鼠脾臟MDSCs的免疫抑制功能。

圖2 GITRL對荷瘤小鼠脾臟MDSCs免疫抑制功能的影響

2.3 GITRL調(diào)控MDSCs胞內(nèi)信號分子的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，GITRL處理30 min后，MDSCs胞內(nèi)JAK2(t=4.056,P<0.05)和STAT3(t=5.452,P<0.01)的磷酸化蛋白水平顯著下降。GITRL處理60 min后，與0 min相比，MDSCs胞內(nèi)JAK2(t=7.376,P<0.01)和STAT3(t=13.340,P<0.01)的磷酸化蛋白水平顯著下降；與30 min相比，MDSCs胞內(nèi)JAK2(t=3.539,P<0.05)和STAT3(t=4.169,P<0.05)的磷酸化蛋白水平顯著下降。見圖3。結(jié)果說明GITRL可下調(diào)MDSCs胞內(nèi)JAK2和STAT3的活性。

圖3 GITRL對MDSCs胞內(nèi)信號分子的調(diào)控

3 討論

研究表明，GITR/GITRL信號系統(tǒng)參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展過程，包括腫瘤、感染、炎癥和自身免疫病[9]。在腫瘤微環(huán)境中，T細(xì)胞表面GITR的表達(dá)明顯升高，GITR信號的觸發(fā)除了能激活效應(yīng)T細(xì)胞，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能，還能促進(jìn)輔助性T細(xì)胞的分化[10-11]，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的抗原提呈功能[12]，參與巨噬細(xì)胞的活化過程[13]，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答。利用抗GITR單克隆抗體DTA-1可通過激活免疫系統(tǒng)增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，有效治療腫瘤[14]。DTA-1通過促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，同時抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫抑制功能，發(fā)揮治療腫瘤的作用。有研究報道，DTA-1對IFN-γ基因缺陷的荷瘤小鼠無治療作用[15]。此外，當(dāng)小鼠體內(nèi)的CD8+T細(xì)胞被清除時，DTA-1對荷瘤小鼠的治療作用消失[16]。以上結(jié)果表明，DTA-1主要通過觸發(fā)CD8+T細(xì)胞表面的GITR信號，增強(qiáng)抗腫瘤免疫。

MDSCs通過抑制宿主免疫反應(yīng)影響腫瘤局部微環(huán)境。MDSCs作為腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制性細(xì)胞，能有效對抗機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并削弱臨床抗腫瘤治療的效果[17]。研究表明，腫瘤局部浸潤的MDSCs數(shù)量與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，且抑制MDSCs的功能或直接清除體內(nèi)MDSCs可有效抑制腫瘤的疾病進(jìn)展[18]。因此，MDSCs是抗腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。目前，臨床上針對MDSCs的療法主要包括抑制MDSCs的分化、遷移、擴(kuò)增和免疫抑制功能，如通過吉西他濱、5-氟尿嘧啶耗竭體內(nèi)的MDSCs，或通過小分子抑制劑和免疫檢查點(diǎn)阻斷劑阻斷MDSCs發(fā)育所需的信號，以達(dá)到治療腫瘤的目的[19]。本研究表明腫瘤微環(huán)境中的MDSCs表達(dá)GITR，且利用GITRL處理MDSCs可顯著下調(diào)其免疫抑制功能，具體表現(xiàn)為MDSCs對野生型小鼠來源的CD4+T細(xì)胞增殖的抑制能力下降，相關(guān)免疫抑制效應(yīng)分子Arg-1和一氧化氮表達(dá)降低，提示GITRL可通過激活MDSCs表面的GITR，抑制MDSCs的免疫抑制功能，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。

JAK/STAT是調(diào)控MDSCs的免疫抑制功能的關(guān)鍵信號通路。研究表明，在肝臟轉(zhuǎn)移性腫瘤模型中，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子通過激活MDSCs胞內(nèi)JAK2/STAT3信號通路促進(jìn)MDSCs的免疫抑制功能，且阻斷JAK2/STAT3信號通路可增強(qiáng)抗腫瘤免疫治療效果。因此，JAK2/STAT3信號通路可調(diào)控MDSCs免疫抑制功能[20]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GITRL通過激活MDSCs表面的GITR，抑制胞內(nèi)JAK2/STAT3信號通路。

綜上，荷瘤小鼠來源的MDSCs表面表達(dá)GITR，GITRL處理可抑制MDSCs胞內(nèi)與其功能相關(guān)的JAK2/STAT3信號通路。因此，GITRL可能通過抑制MDSCs胞內(nèi)JAK2/STAT3信號通路下調(diào)腫瘤微環(huán)境中MDSCs的免疫抑制功能。本研究進(jìn)一步闡釋了GITRL抗瘤免疫機(jī)制，為臨床腫瘤的治療提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。