張一幟，張 媛，李 建，王秀麗，劉元杰，王 楠，徐 磊，辛凌翔，任小俠，劉 博，魏 津，馬 欣，彭小兵，李旭妮，彭國(guó)瑞，李俊平， 羅玉峰

（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081）

活菌計(jì)數(shù)是細(xì)菌類活疫苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中重要的檢驗(yàn)參數(shù)，與疫苗的保護(hù)效果關(guān)系緊密［1］。 現(xiàn)行獸用細(xì)菌類生物制品檢驗(yàn)中的活菌計(jì)數(shù)方法依照《中國(guó)獸藥典》（2015 年版三部）附錄3405“活菌計(jì)數(shù)法”執(zhí)行［2］，但其中有部分內(nèi)容過(guò)于籠統(tǒng)，試驗(yàn)成立條件缺乏科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，以至于全國(guó)各疫苗生產(chǎn)企業(yè)檢驗(yàn)人員對(duì)方法的要求有理解上的差別，造成企業(yè)間乃至同企業(yè)人員間檢驗(yàn)結(jié)果經(jīng)常出現(xiàn)差異，最終影響細(xì)菌活疫苗質(zhì)量的評(píng)判。 因此，本研究擬參照國(guó)內(nèi)外活菌計(jì)數(shù)相關(guān)規(guī)程，通過(guò)試驗(yàn)比對(duì)研究，對(duì)“活菌計(jì)數(shù)法”進(jìn)行修訂，使該方法要求更明確，普適性更高，從而減少操作誤差，提升“活菌計(jì)數(shù)法”的規(guī)范性、可操作性及檢驗(yàn)結(jié)果可靠性。

目前美國(guó)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)生物制品檢驗(yàn)所依照的美國(guó)聯(lián)邦法規(guī)第九卷（9 CFR）中，對(duì)于活菌計(jì)數(shù)方法有著明確要求［3］，并于2015 年完善修訂了標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（BBSOP0019．04）［4］。 相對(duì)于我國(guó)所用的活菌計(jì)數(shù)方法，主要有兩點(diǎn)不同：①在將稀釋液滴加于平板這一操作中，所使用的儀器量程不同，我國(guó)采用1 mL 量程的吸管滴加0．1 mL 菌液，而美國(guó)采用100 ～200 μL 量程的移液器滴加0．1 mL 菌液；②在滴加菌液后，我們目前所用方法是靠?jī)A斜和轉(zhuǎn)動(dòng)將菌液分散，而美國(guó)使用無(wú)菌涂布器將菌液涂布開(kāi)。 本研究針對(duì)當(dāng)前活菌計(jì)數(shù)法三個(gè)方面關(guān)鍵點(diǎn)，參考美國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥生物制品中心公開(kāi)的SOP（BBSOP0019．04）和多位檢驗(yàn)員的操作建議，對(duì)于平板干濕程度、滴加平板儀器、菌液分散方法進(jìn)行單變量比對(duì)試驗(yàn)，提出操作更方便、更精準(zhǔn)、容錯(cuò)率更高的“活菌計(jì)數(shù)法”的修訂方案，并進(jìn)一步提出以標(biāo)準(zhǔn)差（s）衡量結(jié)果的有效性及提供參考值。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 待檢樣品、吸管（1 mL、5 mL、10 mL）、試管（18 mm ×18 cm）、15 mL 離心管、50 mL離心管、培養(yǎng)皿（直徑9 cm）、無(wú)菌涂布器、200 μL移液器和配套吸頭；待檢樣品所需稀釋液及固體培養(yǎng)基（本實(shí)驗(yàn)所用稀釋液及固體培養(yǎng)基均購(gòu)自北京中海生物科技有限公司）參照表1。

表1 不同細(xì)菌產(chǎn)品活菌計(jì)數(shù)用稀釋液及適宜培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)表Tab 1 Correspondence table of diluent and suitable medium for different bacterial products plate count

1．2 儀器設(shè)備 微波爐、恒溫水浴箱、生物安全柜、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱、渦旋振蕩儀、電動(dòng)移液器、廢棄液體及吸管存放用容器。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 培養(yǎng)平板制備 根據(jù)待檢樣品種類選取相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，冷卻至50 ～60 ℃后于生物安全柜中加入相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)成分（37 ℃預(yù)熱）后制備平板，每付培養(yǎng)皿加入瓊脂15 ～20 mL。 待平板凝固后進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)或裝入塑封袋4 ℃保存。

1．3．2 稀釋菌液 按待檢產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的每頭（羽）份樣品應(yīng)至少含有的活菌數(shù)或科研實(shí)驗(yàn)要求確定樣品的稀釋倍數(shù)。 先進(jìn)行放大稀釋，再進(jìn)行10 倍系列稀釋，稀釋過(guò)程中通過(guò)使用渦旋振蕩器或上下顛倒混勻保證菌液稀釋液充分混勻，最終稀釋度選擇每付培養(yǎng)皿上生長(zhǎng)的菌落數(shù)40 ～200 CFU 為宜。

1．3．3 滴平板 用1 mL 吸管或200 μL 移液器分別從最終稀釋管中吸取菌液，滴于3 個(gè)平板上，100 μL／平板。 之后轉(zhuǎn)動(dòng)平板或用無(wú)菌涂布器將菌液涂均勻（3 個(gè)平板用同一個(gè)涂布器的同一邊進(jìn)行涂布，涂布時(shí)注意不要將菌液涂布到平板邊緣）。之后蓋上平板蓋正置于培養(yǎng)箱中，30 min 后將平板倒置，培養(yǎng)至適宜時(shí)間。

1．3．4 計(jì)算菌數(shù) 肉眼觀察并計(jì)數(shù)平板中的菌落，算出3 個(gè)平板的平均菌落數(shù)，再乘以總體稀釋度（包括放大稀釋和連續(xù)稀釋）倍數(shù)，再乘以10（每付平板滴加菌液0．l mL），即為每1．0 mL 原樣品中所含的菌數(shù)，再除以疫苗的頭（羽）份數(shù)，即為每頭（羽）份疫苗中所含有的活菌數(shù)。

1． 3． 5 數(shù) 據(jù)統(tǒng)計(jì) 使用GraphPad Prism 6． 0（GraphPad， La Jolla， CA， USA） 軟件以及SPSS 16．0軟件對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中以平均值±標(biāo)準(zhǔn)平均誤差（） 表示。 數(shù)據(jù)分析采用t檢驗(yàn)法來(lái)比較各組間差異。 其中ns （P＞0．05），即no significant，表示無(wú)顯著差異，?（P＜0．05）表示有顯著差異，??（P＜0．01） 表示差異十分顯著。

2 結(jié)果與分析

2．1 活菌計(jì)數(shù)法相關(guān)步驟的優(yōu)化

2．1．1 平板干濕程度 《中國(guó)獸藥典》（2015 年版三部）附錄3405 收錄的“活菌計(jì)數(shù)法”對(duì)于平板干濕程度沒(méi)有提出明確要求。 檢驗(yàn)員們的多年操作經(jīng)驗(yàn)均認(rèn)為平板干濕程度對(duì)于活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)至關(guān)重要。 為確定平板干濕程度，考慮到操作方法的普適性和易操作性，本研究采取將制備平板完成后（平板凝固）進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，以預(yù)培養(yǎng)時(shí)間量化平板干濕程度。 本次試驗(yàn)使用仔豬副傷寒沙門(mén)氏菌活疫苗參考品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，馬丁瓊脂平板在制備完成凝固后（倒板后30 min），轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)0．5 ～48 h 不等（圖1）。 分別取出預(yù)培養(yǎng)不同時(shí)間的馬丁瓊脂平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，將適宜濃度的菌液滴加至平板上，轉(zhuǎn)動(dòng)傾斜引導(dǎo)菌液在平板上均勻分散之后放入培養(yǎng)箱中，在不開(kāi)蓋的情況下正置30 min后倒置培養(yǎng)24 h，觀察各個(gè)平板中菌落是否出現(xiàn)堆疊、是否在邊緣生長(zhǎng)并記錄計(jì)數(shù)結(jié)果。

圖1 不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)結(jié)果（0．5 ～48 h）Fig 1 Bacterial plate count results on plates with different pre－culture time （0．5 ～48 h）

結(jié)果顯示平板預(yù)培養(yǎng)12 ～24 h 后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)?zāi)軌蝽樌?jì)數(shù)，菌落分布無(wú)異常情況。 而預(yù)培養(yǎng)小于12 h 的平板會(huì)因過(guò)濕而導(dǎo)致菌落堆疊、菌落貼邊生長(zhǎng)，最終無(wú)法計(jì)數(shù)。 預(yù)培養(yǎng)48 h 由于平板過(guò)干，菌液無(wú)法充分分散，部分菌落出現(xiàn)重疊情況，從而影響計(jì)數(shù)結(jié)果。 因此平板最好預(yù)培養(yǎng)12 ～24 h后再進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)。

2．1．2 滴加菌液 將稀釋液滴加于平板這一操作步驟，目前采用1 mL 量程的吸管滴加0．1 mL 菌液的方法，而美國(guó)與歐洲使用100 ～200 μL 量程的移液器滴加0．1 mL 菌液。 在正確合規(guī)的操作下，引用誤差越小，準(zhǔn)確度越高，而引用誤差是絕對(duì)誤差的最大值與儀表量程的比值，即與儀器量程負(fù)相關(guān)［5］。 從儀器規(guī)格來(lái)看，選用量程更符合使用體積的儀器更為精確。

為驗(yàn)證兩種滴加菌液方法對(duì)于活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)的影響，本研究分別使用兩種方法進(jìn)行多次活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)，所用樣品及其他步驟完全相同，將所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果說(shuō)明使用移液器滴加菌液方法與傳統(tǒng)方法無(wú)顯著性差異，可以互相替代，而且移液器滴加菌液方法的標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤均小于傳統(tǒng)方法，說(shuō)明移液器方法的離散程度更低，隨機(jī)誤差更小（表2 和圖2）。

表2 不同儀器滴加菌液活菌計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab 2 Bacterial plate count statistics with different instruments

圖2 不同儀器滴加菌液活菌計(jì)數(shù)結(jié)果Fig 2 Bacterial plate count results with different instruments

2．1．3 菌液分散 將稀釋液滴加于平板這一操作步驟，我國(guó)目前采用傾斜和轉(zhuǎn)動(dòng)平板將菌液分散，而美國(guó)與歐洲使用無(wú)菌涂布器將菌液涂布開(kāi)。 為驗(yàn)證兩種菌液分散方法對(duì)于活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)的影響，本研究分別按照傳統(tǒng)旋轉(zhuǎn)傾斜法和涂布法進(jìn)行菌液分散，進(jìn)行多次活菌計(jì)數(shù)試驗(yàn)，所用樣品及其他步驟完全相同，將所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果顯示使用涂布器分散菌液方法與傳統(tǒng)方法無(wú)顯著性差異，可以互相替代，而且涂布器分散菌液方法的標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤均小于傳統(tǒng)方法，說(shuō)明涂布法的離散程度更低，隨機(jī)誤差更?。ū? 和圖3）。

表3 不同菌液分布方式活菌計(jì)數(shù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab 3 Bacterial plate count statistics in different distribution methods

圖3 不同菌液分布方式活菌計(jì)數(shù)結(jié)果Fig 3 Bacterial plate count results in different distribution methods

2．2 修訂方法與傳統(tǒng)方法比對(duì) 本研究第一部分通過(guò)單變量試驗(yàn)確定了平板適宜預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間，之后驗(yàn)證使用移液器滴加菌液和用涂布器分散菌液可以替代原方法，且結(jié)果的離散程度小于原方法。在原方法的基礎(chǔ)上，使用移液器滴加菌液和用涂布器分散菌液，在此我們稱之為“修訂方法”。 第二部分我們使用修訂方法與目前的傳統(tǒng)方法進(jìn)行比對(duì)。將同一樣品分別使用傳統(tǒng)方法和修訂方法進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)，結(jié)果顯示兩種方法沒(méi)有顯著性差異，可以互相替代，而且修訂方法的標(biāo)準(zhǔn)差和標(biāo)準(zhǔn)誤均小于傳統(tǒng)方法，說(shuō)明修訂方法的離散程度更低，隨機(jī)誤差更?。ū? 和圖4）。

圖4 活菌計(jì)數(shù)傳統(tǒng)方法與修訂方法比對(duì)結(jié)果Fig 4 Comparison between traditional method and revised method for bacterial plate count

表4 活菌計(jì)數(shù)傳統(tǒng)方法與修訂方法比對(duì)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab 4 Comparison between traditional method and revised method for bacterial plate count

2．3 結(jié)果平行性條件優(yōu)化 在《中國(guó)獸藥典》（2015 年版三部）附錄3405 收錄的“活菌計(jì)數(shù)法”中，在重檢要求中對(duì)于結(jié)果平行性方面做出了規(guī)定：“如果有片狀菌落生長(zhǎng)，或同一稀釋度平板間菌落相差50%以上時(shí)，應(yīng)重檢?！逼渲袑?duì)于活菌計(jì)數(shù)結(jié)果平行性的要求表述過(guò)于籠統(tǒng)，（最大值－最小值）／N≥50%則該次檢驗(yàn)不成立，而其中N 并沒(méi)有明確指出是什么值，是否是平均值或其他具體某一個(gè)樣本數(shù)值，以至于該評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)在實(shí)際應(yīng)用中會(huì)產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)不一的問(wèn)題。 “最大值－最小值”在統(tǒng)計(jì)學(xué)中稱為極差，是用來(lái)反映刻畫(huà)一組數(shù)據(jù)的離散程度和變異范圍，但由于極差只指明了測(cè)定值的最大離散范圍而不包括全部測(cè)量值的信息，并且極差易受極端值影響，因此不能反映其間樣本的分部情況。此外，從公式（最大值－最小值）／N 值可以看出，數(shù)值大小與N 的關(guān)系成反比。 在活菌計(jì)數(shù)結(jié)果在規(guī)定范圍（40 ～200）內(nèi)的情況下，N（一般取平均值）越低，（最大值－最小值）／N 值越大，即此種方法對(duì)于數(shù)據(jù)離散性的衡量會(huì)因N 值大小不同產(chǎn)生差異。

本研究提出使用標(biāo)準(zhǔn)差作為衡量活菌計(jì)數(shù)結(jié)果平行性的指標(biāo)［6］。 為確定既符合現(xiàn)行平行性要求，又符合活菌計(jì)數(shù)結(jié)果實(shí)際情況的標(biāo)準(zhǔn)差值，我們將本研究中進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)（表5）以及多位檢驗(yàn)員驗(yàn)證活菌計(jì)數(shù)修訂方法的數(shù)據(jù)（均符合當(dāng)前數(shù)據(jù)平行性規(guī)定）（表6、表7）進(jìn)行整理，計(jì)算每組結(jié)果（3 個(gè)平板為一組）的標(biāo)準(zhǔn)差和傳統(tǒng)方法中提出的“（最大值－最小值）／平均值”。

表5 本研究活菌計(jì)數(shù)結(jié)果平行性指標(biāo)分析－1Tab 5 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study－1

表6 本研究活菌計(jì)數(shù)結(jié)果平行性指標(biāo)分析－2Tab 6 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study－2

如表5 －表7 所示，各組結(jié)果的極差／平均值均在50%以內(nèi)，符合現(xiàn)行結(jié)果平行性要求。 而各組標(biāo)準(zhǔn)差值均小于20，且浮動(dòng)范圍較為集中于15 ～5 之間，占整個(gè)樣本量的74%。 這說(shuō)明即使在操作符合規(guī)定的情況下，每次檢驗(yàn)的3 個(gè)結(jié)果之間還是會(huì)出現(xiàn)差距，這是由試驗(yàn)當(dāng)中的隨機(jī)誤差所引起的，而標(biāo)準(zhǔn)差正是衡量此隨機(jī)誤差的一把尺子，應(yīng)當(dāng)符合隨機(jī)誤差的基本規(guī)律——呈正態(tài)分布。 使用SPSS16．0 軟件對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)進(jìn)行兩種正態(tài)分布檢驗(yàn)（Shapiro － Wilk 檢驗(yàn)及Kolmogorov － Smirnov檢驗(yàn)），結(jié)果均為顯著（Sig ＞0． 05 即正態(tài)分布）（圖5 －圖7），這證實(shí)了前文中的觀點(diǎn)，說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)差可以作為衡量活菌計(jì)數(shù)結(jié)果平行性的標(biāo)準(zhǔn)，并能夠有效地描述隨機(jī)誤差。

圖5 標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果－1Fig 5 Normal distribution test results of Standard Deviation data－1

圖6 標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果－2Fig 6 Normal distribution test results of Standard Deviation data－2

圖7 標(biāo)準(zhǔn)差數(shù)據(jù)正態(tài)分布檢驗(yàn)結(jié)果－3 Fig 7 Normal distribution test results of Standard Deviation data－3

表7 本研究活菌計(jì)數(shù)結(jié)果平行性指標(biāo)分析－3Tab 7 Analysis of the parallel index of the bacterial plate count in this study－3

3 討論與結(jié)論

國(guó)內(nèi)外目前對(duì)活細(xì)菌的計(jì)數(shù)有許多方法，其中滴板計(jì)數(shù)是一種比較常用且簡(jiǎn)便的計(jì)數(shù)方法。 該方法根據(jù)估算對(duì)于液體菌液進(jìn)行2 ～10 倍梯度稀釋，之后將終稀釋液滴加到計(jì)數(shù)板上，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，之后乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，能夠快速即時(shí)測(cè)得菌液中的活菌數(shù)量［7］。 Seo EY 等利用熒光顯微技術(shù)對(duì)于大量細(xì)菌進(jìn)行快速計(jì)數(shù)［8］。 Bogomolny E等建立了利用固體激光器使用光學(xué)方法實(shí)時(shí)測(cè)定活細(xì)菌數(shù)量的方法，結(jié)果穩(wěn)定、高效、精確［9］。London R 等開(kāi)發(fā)了自動(dòng)化生長(zhǎng)微生物直接檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)微生物熒光標(biāo)記和激發(fā)熒光，能夠快速自動(dòng)區(qū)分不同的原核、真核微生物并即時(shí)完成計(jì)數(shù)［10］。 這些先進(jìn)方法或需要使用昂貴的儀器試劑，或需要對(duì)不同細(xì)菌的估算值進(jìn)行更多的數(shù)據(jù)積累。

本研究針對(duì)當(dāng)前活菌計(jì)數(shù)法的三個(gè)方面關(guān)鍵點(diǎn)，參考美國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥生物制品中心公開(kāi)的SOP（BBSOP0019．04）和多位檢驗(yàn)員的操作建議，通過(guò)單變量比對(duì)試驗(yàn)改進(jìn)了活菌計(jì)數(shù)平板的干濕度要求，使得檢驗(yàn)用平板干濕程度能夠?qū)崿F(xiàn)均勻分散且不易流邊，同時(shí)排除了之前方法當(dāng)中的生物安全隱患；確定了滴平板儀器，使用量程更適合、精確度更高、操作更方便的儀器進(jìn)行菌液的滴加，減少了系統(tǒng)誤差并且使得操作更為簡(jiǎn)單；選擇涂布器進(jìn)行菌液分散，也使得整個(gè)方法更易操作，菌落分散均勻且不易流邊。

原方法中對(duì)于各平板結(jié)果平行性的要求較為模糊，缺少統(tǒng)計(jì)學(xué)支撐。 本研究提出使用標(biāo)準(zhǔn)差衡量活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的平行性，標(biāo)準(zhǔn)差是離均差平方的算數(shù)平均數(shù)的平方根，即方差的算術(shù)平方根，是反映一組數(shù)據(jù)離散程度最常用的一種量化形式，是表示精確度的重要指標(biāo)。 當(dāng)使用活菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于檢測(cè)方法總是有誤差的，所以檢測(cè)值并不是其真實(shí)值。 設(shè)定一個(gè)只取決于檢測(cè)值與真實(shí)值之間的差距，而與真實(shí)值大小無(wú)關(guān)的穩(wěn)定性指標(biāo)，才是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法最有決定性的指標(biāo)，從而保證每批檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠［11］。 進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)證實(shí)，活菌計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中隨機(jī)誤差所引起的結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差變化，是符合隨機(jī)誤差的基本規(guī)律——呈正態(tài)分布的。

本研究以試驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，比對(duì)分析后對(duì)于相關(guān)規(guī)程制修訂提出了意見(jiàn)，希望能夠?qū)?xì)菌類獸用生物制品相關(guān)從業(yè)者在生產(chǎn)研究、制定規(guī)程等方面提供幫助和啟發(fā)。