汪盼盼 楊野 劉迪秋 崔秀明 劉源

（昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 云南省三七資源可持續(xù)發(fā)展利用重點實驗室 國家中醫(yī)藥管理局三七資源可持續(xù)發(fā)展利用重點研究室昆明市道地藥材可持續(xù)發(fā)展利用重點實驗室，昆明 650500）

植物病害是嚴(yán)重危害農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的病害之一，植物病害的發(fā)生與作用機(jī)制，一直是研究的熱點和難點。病原體可以通過多種途徑感染植物，當(dāng)植物不能與病原體抗衡時，植物將會被病原體侵蝕。研究發(fā)現(xiàn)病害的發(fā)生主要與植物根際微生物和病毒的多樣性以及植物自身的免疫力相關(guān)。隨著研究的深入，越來越多植物病害的發(fā)生及作用機(jī)制被揭示。

傳統(tǒng)微生物組研究為獲得植物中的病原物，常采用酶標(biāo)記抗體檢測［1］、特異性單克隆抗體鑒定［2］或采用酶聯(lián)免疫吸附法和PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，用于植物病原菌和病毒的檢測［3］。但環(huán)境中的微生物具有多樣性，約99.8%的微生物不能通過常規(guī)方法被鑒定［4］。宏基因組學(xué)與傳統(tǒng)微生物組研究方法不同，可直接提取和鑒別環(huán)境中微生物的總DNA或RNA，理論上可獲取所有環(huán)境微生物或病毒的基因信息，為植物病害的研究提供了便利［5］。目前，宏基因組學(xué)已被用于不同宏環(huán)境中微生物和病毒的研究，如來自土壤中的細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌和病毒，以及海水中微生物的研究［6］。本文重點介紹宏基因組學(xué)的分析策略，以及在植物病害研究中的應(yīng)用。

1 宏基因組學(xué)

1.1 宏基因組學(xué)概述

宏基因組學(xué)最早由威斯康辛大學(xué)植物病理學(xué)部門的Handelsman等在1998年提出，宏基因組學(xué)是應(yīng)用現(xiàn)代基因組學(xué)技術(shù)直接研究自然狀態(tài)下微生物的有機(jī)群落，而不需要在實驗室中分離單一菌株的科學(xué)［7］，即以多物種基因組為研究對象，利用分子生物學(xué)研究手段，對環(huán)境中微生物進(jìn)行研究的科學(xué)。主要通過對特定環(huán)境中全部微生物的核酸進(jìn)行提取，構(gòu)建測序文庫，上機(jī)測序然后對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、組裝、比對和注釋，獲得特定環(huán)境中的所有微生物，或根據(jù) rDNA 數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物，最后借助生物信息學(xué)，獲得其生物多樣性和基因功能等信息。宏基因組的分析流程見圖1。

圖1 宏基因組的分析流程示意圖

1.2 宏基因組的分析策略

自然界的微生物種類繁多，且種內(nèi)和種間存在著差異，為獲得更全面的基因信息，研究者采用高通量測序技術(shù)對特定環(huán)境樣本進(jìn)行深度測序，并開發(fā)相應(yīng)的生物信息學(xué)分析策略和軟件，發(fā)現(xiàn)微生物之間的差異，同時這些分析策略和軟件促進(jìn)了交叉學(xué)科的發(fā)展。

經(jīng)過建庫測序得到的堿基序列用FastQC和KneadData等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控，包括去除測序接頭、去除宿主、去除低質(zhì)量堿基等。得到的高質(zhì)量序列用Kraken2或MEGAHIT等軟件進(jìn)行有參或無參分析。有參分析是針對有參考基因組的情況，首先將所有測序片段通過序列比對定位到參考基因組上，挑選出匹配好的片段用于后續(xù)分析［8］；無參分析由于無參考基因組，其組裝結(jié)果一般為contigs，目前廣泛應(yīng)用于從頭解析未知物種的基因組序列、基因組成和進(jìn)化特征等。再用Prokka［9］進(jìn)行基因注釋和物種分類，對注釋好的基因組，可構(gòu)建非冗余基因集來描述環(huán)境中基因的整體信息。通過注釋和物種分類可發(fā)現(xiàn)一些新的植物病原微生物以及微生物之間的功能差異基因。

目前，宏基因組學(xué)已經(jīng)成為生物學(xué)最前沿的研究領(lǐng)域之一。測序技術(shù)已從依賴 DNA 聚合酶的生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槲锢韺W(xué)中納米技術(shù)的新領(lǐng)域［10］。如第三代測序技術(shù)可通過零模波導(dǎo)孔，在單一DNA片段上邊合成邊測序，同時不再進(jìn)行DNA擴(kuò)增［10］，可使有效數(shù)據(jù)量更高，測序片段更長，再結(jié)合相應(yīng)的生物信息學(xué)方法，提高了對宏環(huán)境樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的分析能力，增加了發(fā)現(xiàn)新病原微生物的可能。

2 宏基因組學(xué)與植物病害

2.1 植物根際中微生物的多樣性

根際是植物根系所包圍和影響的狹長地帶，是眾多生物活動的熱點區(qū)域，根際生態(tài)系統(tǒng)中包含無數(shù)的根際微生物，是最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)之一［11］。根際微生物會直接或間接的影響自然植物群落的組成和生物量［12-13］。地下微生物物種豐富程度被認(rèn)為是地上植物多樣性和生物量的預(yù)測因子［14］。根際微生物由于其豐度的差異對植物有益有弊［15］。迄今為止，對植物與根際微生物之間的相互作用已有許多研究，包括各種病原菌、共生根瘤菌和菌根真菌［16-17］。

本課題組通過對氯化苦熏蒸處理后土壤中的微生物菌群分析發(fā)現(xiàn)，氯化苦熏蒸土壤能顯著防治三七的連作障礙，但細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量分別降低了50%、19%和38%［18］。通過16S rDNA測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)氯化苦消毒處理后，主要三七致病菌假單胞菌屬（Pseudomonas）和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）占比均出現(xiàn)顯著下降［19］。

根際微生物可促進(jìn)根對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和防御病原物的入侵，但是關(guān)于微生物對植物生長、健康和疾病帶來的影響知之甚少，亦有研究發(fā)現(xiàn)人類致病菌在植物組織上擴(kuò)散［20-23］。闡明根際微生物群落的形成和變化過程，不僅是植物保護(hù)的需要，也是人類健康的保障。

2.2 植物病原菌導(dǎo)致作物經(jīng)濟(jì)損失

多數(shù)植物病害由低等動物、微生物和病毒等的復(fù)合作用引起，這些病原體攻克了根際為植物提供的防御層，引起植物病害，導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

研究表明真菌是真核生物中最具多樣性的類群之一，也是土壤微生物群落的重要組成部分［24］。真菌和卵菌引起的典型癥狀包括根腐、潰瘍、萎蔫、葉和芽的損傷。馬鈴薯枯萎病的致病菌Phytophora infestans被證明是1845年-1852年間愛爾蘭大饑荒的罪魁禍?zhǔn)祝?5］。西洋參的連作障礙嚴(yán)重影響西洋參的產(chǎn)率，造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，而土壤微生物群落的變化是引起西洋參連作障礙的主要原因。Punja等［26］采用NGS測序和依賴培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，利用分子和形態(tài)學(xué)的特征，分析西洋參根際真菌多樣性，篩選出多種病原菌，包括鏈格孢菌（Alternaria panax）、柱狀芽孢桿菌（Cylindrocarpon destructans）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）等真菌。豌豆產(chǎn)量主要受豌豆根腐病的影響，豌豆的根腐病由多種病原菌引起，其中真隱孢子蟲是全球豌豆根腐病重要的卵菌病原［27］，研究者利用宏基因組學(xué)，確定了加拿大草原豌豆根腐病相關(guān)卵菌的類型和豐度［28］。也有研究者利用宏基因組學(xué)手段獲得了導(dǎo)致柑橘黃龍病的植物病原菌“亞洲假絲酵母（Candidatus Liberibacter asiaticus）”的完整序列［29］。由病原菌引起的馬鈴薯枯萎病、人參屬物種的連作障礙、豌豆根腐病以及柑橘黃龍病等植物病害給植物的生產(chǎn)和利用造成了極大的損失，現(xiàn)利用宏基因組學(xué)可直接從環(huán)境樣品中定位真菌的種類，加快植物病害的發(fā)現(xiàn)和診斷過程，為植物病害的防治提供了有效的手段。

2.3 植物益生菌可提高植物對病害的防御能力

研究顯示固氮菌、根瘤菌、根際促生菌和生防微生物等植物益生菌為植物抵御病原菌的入侵提供了幫助［30］，且微生物不同成員可在感染前和感染期間，以及在根組織中的傳播期間對抗植物病原菌。

生活在植物體內(nèi)的有益微生物可以促進(jìn)植物的健康生長，但有益微生物的基因組和功能基因在很大程度上仍然未知。Rudrappa等［31］利用宏基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)，Pst DC3000可以誘導(dǎo)擬南芥根系分泌蘋果酸（MA），MA以劑量依賴的方式選擇性地發(fā)出信號并招募有益的枯草芽孢桿菌（FB17），促進(jìn)FB17與擬南芥根系結(jié)合和生物膜的形成，從而抵御病原菌的侵害。Carrión等［32］采用宏基因組學(xué)發(fā)現(xiàn)先前未確認(rèn)的黃桿菌NRPS-PKS基因簇對內(nèi)生菌群的疾病抑制至關(guān)重要。Manoj等［33］通過高通量和鳥槍法基因組測序比較有癥狀和無癥狀香蕉植株的內(nèi)生菌群。結(jié)果表明，香蕉根際內(nèi)生菌群主要是蛋白菌和類桿菌，其次是放線菌。香蕉根際內(nèi)生菌有望成為防治香蕉枯萎病和其它植物病原菌的生物防治劑。也有研究發(fā)現(xiàn)植物根際可以分泌揮發(fā)性有機(jī)物（Volatile organic compounds，VOCs），VOCs能夠通過土壤中的孔隙擴(kuò)散［34］，抑制真菌病原體的菌絲生長，保護(hù)植物免受真菌病原體的侵害［35］。目前，利用宏基因組學(xué)已發(fā)現(xiàn)許多植物益生菌，未來可將植物益生菌運用到植物病害的生物防治方法中。

2.4 植物病毒的多樣性

19世紀(jì)90年代人們發(fā)現(xiàn)了煙草花葉病毒，開創(chuàng)了植物病毒學(xué)領(lǐng)域［36］。然而植物病毒學(xué)的大部分研究都集中在農(nóng)作物和觀賞植物中的致病病毒，但宏基因組研究表明，野生植物中的病毒也非常豐富，而且被病毒感染的植物通常無癥狀［36］，另外互惠型植物病毒的例子很少。

2.4.1 馴化植物中的病毒 在植物病毒的研究中，對馴化植物的病毒研究最多。多項研究表明，病毒性病原體可引起葡萄產(chǎn)量和葡萄酒產(chǎn)品質(zhì)量以及葡萄園的生產(chǎn)壽命下降［37］。Xiao等［37］利用宏基因組分析揭示了復(fù)雜的葡萄病毒組，包括葡萄卷葉病毒3 號（Grapevine leafrollassociated virus 3）的兩個新變種，加深了對復(fù)雜藤蔓植物病毒基因多樣性的認(rèn)識，有助于探索葡萄卷葉病的作用機(jī)制，促進(jìn)葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。桃作為世界上溫帶和亞熱帶地區(qū)重要的水果，桃樹很容易感染致病病毒，對桃的產(chǎn)量以及質(zhì)量有很大影響。桃樹病毒的檢測和鑒定是桃樹病毒學(xué)研究的關(guān)鍵。Zhou等［38］利用宏基因組學(xué)技術(shù)檢測出新型的ssRNA病毒，命名為peach virus 1，為戰(zhàn)勝桃樹致病病毒提供了有利的條件。仙人掌（Opuntiasp.）是墨西哥栽培的重要美食作物，但是一直被Potexviruses opuntia virus X、Schlum-bergera virus等病毒困擾，Héctor等［39］利用宏基因組學(xué)在仙人掌中檢測出煙草病毒屬的一個新種，命名為“仙人掌病毒2號”，為仙人掌病害的防治提供了參考。

2.4.2 野生植物中的病毒 野生植物中可能藏有無數(shù)未知的病毒，以前受實驗檢測技術(shù)的限制，很多野生植物中的病毒都未被發(fā)現(xiàn)。最近基于高通量測序技術(shù)，特別是針對microRNA的測序方法，能夠從野生宿主中發(fā)現(xiàn)病毒，研究這些潛在的病原，有助于預(yù)測疾病的出現(xiàn)［40］。Susi等［40］從奧蘭采集的柳葉車前草中鑒定出一種新的柳葉車前草潛伏病毒Plantago lanceolata latent virus（PlLV），并 通 過深度測序確定病毒的多樣性和流行率。結(jié)果表明奧蘭群島的柳葉車前草種群中的5種病毒（Plantago lanceolata latent virus、Caulimovirus、Betapartitivirus、Enamovirus和Closterovirus）的流行率各不相同。最后成功地開發(fā)出用樹液和蚜蟲接種PlLV、Caulimovirus和Enamovirus的防治策略［41］。Power等［42］研究了黃體病毒-黃矮病毒/谷類黃矮病毒（Cereal yellow dwarf virus，BYDV/CYDV）復(fù)合物在北美草原上的流行特征，發(fā)現(xiàn)病毒的流行是由植物群落內(nèi)部以及植物、昆蟲、食草動物和非生物因素之間的相互作用決定。Moore等［43］研究表明野生草原植物群落的組成對BYDV/CYDV復(fù)合物的傳播具有重要影響。Malmstrom等［44-45］對加利福尼亞草原的研究表明，入侵物種可通過吸引更多蚜蟲到該區(qū)域，然后將病毒傳播到易受感染的本地草原，從而促進(jìn)BYDV/CYDV的傳播，并增強(qiáng)外來物種的入侵。對野生植物中病毒的多樣性進(jìn)行研究，可能會對野生植物自然種群的生態(tài)進(jìn)化過程產(chǎn)生新的認(rèn)識。研究者可利用宏基因組學(xué)技術(shù)去發(fā)現(xiàn)潛在的植物病毒，為植物病害的防治提供方法。

2.4.3 植物與病毒的互利共生 通常認(rèn)為植物病毒是有害的，但是一些研究結(jié)果表明植物病毒可通過多種方式對宿主產(chǎn)生積極影響。在某些情況下，病毒增強(qiáng)了植物抵抗非生物脅迫的能力［46］（表1）。

表1 互惠病毒案例

2.5 植物病害的防治方法

據(jù)估計，全球每年約有10%-20%的糧食因植物病害而損失。目前，人們越來越抵制化學(xué)制劑的濫用，因此迫切需要更好的方法來控制植物病原體，以維持和提高作物產(chǎn)量，并確保未來的糧食安全。生物防治作為一種防治植物疾病，特別是土傳疾病的手段，由于其安全無毒，在植物病害的防治中越來越重要。常見的生物防治方法是有目的地引入微生物制劑和富集植物根際的有益微生物來抑制植物病原體的活動［52］。宏基因組的研究有助于了解土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)，發(fā)掘有益微生物以及了解微生物的作用機(jī)理。

在生物防治方法中，引入具有多種作用機(jī)制或具有多種生態(tài)需求的生物防治劑日趨成熟［53］。許多有益微生物，特別是內(nèi)生菌，被植物根系分泌的有機(jī)酸所吸引，產(chǎn)生生物膜，誘導(dǎo)植物抗病。引入的菌株必須在潛在的感染部位存活很長一段時間，而且在缺乏植物的情況下，微生物制劑必須在資源有限的土壤環(huán)境中保持休眠狀態(tài)，該微生物制劑還必須具有迅速改變其生理狀態(tài)的能力，進(jìn)入快速生長階段，與病原體進(jìn)行營養(yǎng)元素競爭［54］。例如熒光假單胞菌株在根際中富集，這些菌株具有與宿主內(nèi)胚層定殖相一致的代謝范圍，這一特性可以提高菌株的持久性，從而抑制疾病［55］?，F(xiàn)通過宏基因組測序已能夠預(yù)測微生物制劑是否對目標(biāo)病原體有作用，亦可通過基因組學(xué)與數(shù)據(jù)挖掘相結(jié)合，篩選出用于生物防治劑的候選菌株［56］，結(jié)合代謝組學(xué)，還可能發(fā)現(xiàn)新的、具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物［57］。目前的研究表明許多具有不同特性的有益根際微生物制劑已被引入土壤、種子和種植材料中，以提高植物對病害的防御能力［58］。

但是，不合適的微生物制劑由于接種的根際環(huán)境不適宜，或與本地微生物群爭奪資源，以及干擾本地微生物群，往往無效或有害［59］。利用植物病原菌的特異性噬菌體進(jìn)行生物防治，可以保護(hù)原根際微生物群，進(jìn)行更精準(zhǔn)的生物防治［60］。噬菌體的主要優(yōu)點是其宿主特異性，在存在宿主細(xì)菌的情況下，具備快速繁殖的能力，還可以在周圍的微生物群不受影響的情況下靶向殺死病原體。2019年，Wang等［61］利用噬菌體聯(lián)合治療番茄青枯病，在受番茄青枯病菌污染的農(nóng)田中發(fā)現(xiàn)增加噬菌體數(shù)量可以提高噬菌體的生物防治效果，且不影響原有的根際微生物群，表明噬菌體治療是一種安全環(huán)保的植物病原菌抑制方法。在未來，利用噬菌體進(jìn)行生物防治具有廣闊的前景。

另外有研究表明RNA沉默具有抗病毒的作用［62］，植物病毒可編碼專門的運動蛋白，以修改胞間連絲通道，從而允許病毒RNA復(fù)合物或病毒樣顆粒的細(xì)胞間運動［63］，利用RNA沉默調(diào)控機(jī)制，無疑是提高植物病害防治的有效方法之一。

綜上所述，生物防治是控制植物病害的有效方法，利用宏基因組學(xué)不僅可以探明微生物的群落結(jié)構(gòu)，了解植物根際微生物特征，還可以為生物防治提供有效的研究思路，開發(fā)出新的生物防治方法，減少植物病害的發(fā)生。

3 問題與展望

高通量測序技術(shù)對植物病害研究具有里程碑的意義，引領(lǐng)了科學(xué)研究模式的革新和研究思維的轉(zhuǎn)變。宏基因組學(xué)借助高通量測序技術(shù)已對植物根際微生物、植物病毒等諸多方面展開了深入的研究。為進(jìn)一步篩選出更多植物益生菌、探究植物與病毒之間的多樣性、促進(jìn)植物病害的防治，有以下幾點需要注意。

（1）高通量測序技術(shù)解決了傳統(tǒng)微生物組學(xué)的技術(shù)難題，在宏基因組學(xué)研究中扮演著重要的角色，但是物種的鑒定在很大程度上依賴于序列信息、參考基因組、分析軟件和數(shù)據(jù)庫，然而由于數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的不完善和不準(zhǔn)確，這種基于序列的識別可能是錯誤的，物種分類結(jié)果不一定準(zhǔn)確。針對這些缺陷，需要借助額外的數(shù)據(jù)和實驗驗證步驟加以彌補。

（2）植物根際生態(tài)系統(tǒng)是最復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)之一，包含了多種多樣的微生物，隨著對植物根際微生物的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)它們之間的相互作用以及各自的作用機(jī)制仍待闡明。在一些研究中發(fā)現(xiàn)宏環(huán)境中可能存在致病的人類病原體，如根際環(huán)境調(diào)查中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致皮膚、傷口和尿路感染的其他細(xì)菌種類［64］，但對其毒性的了解相對較少。

（3）之前對植物病毒的理解大多都與植物病害有關(guān)，現(xiàn)在通過研究發(fā)現(xiàn)一些病毒與植物具有互利共生的關(guān)系。另外野生植物病毒的多樣性及其作用機(jī)制的研究還處于起步階段，利用宏基因組學(xué)將提供更加可靠的病毒檢測和病害診斷依據(jù)，再科學(xué)的利用有益的植物病毒，開發(fā)有效的生物防治策略，對減少植物病害，降低經(jīng)濟(jì)損失有更高的推廣價值。

（4）在植物病害防治中，微生物制劑，噬菌體療法以及RNA沉默等方法發(fā)揮了重要的作用。利用宏基因組學(xué)技術(shù)，檢測微生物制劑在植物根際對其它病原生微生物群落的影響，可以更加明確微生物制劑的作用效果及機(jī)理。另外明確生態(tài)系統(tǒng)中生防因子-環(huán)境-病原菌之間的相互關(guān)系，更加全面地了解微生物間的拮抗和促進(jìn)機(jī)理，進(jìn)而在實施生物防治時，能動態(tài)的調(diào)節(jié)生物防治劑與病原菌之間的平衡，達(dá)到防治病害過程中生物防治劑的供求平衡，滿足不破壞生態(tài)環(huán)境的要求。

隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組學(xué)將為植物病害的生物防治提供更加廣闊的研究方法和手段，并將推動生物醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、生物能源和生物技術(shù)等各大領(lǐng)域的快速發(fā)展。